• Xông hương:
  Nhỏ 3-5 giọt tinh dầu và khoang chứa nước của đèn xông hoặc máy khuếch tán tinh dầu. Nên kết hợp nhiều loại tinh dầu để đạt được hiệu quả tối đa.
• Massage:
  Phối trộn 10 giọt tinh dầu với 30ml dầu nền (dầu bơ, dầu dừa). Giúp thư giãn cơ thể, cân bằng trạng thái tinh thần.
• Tắm với tinh dầu:
  Sử dụng 5-10 giọt tinh dầu, ngâm mình trong bồn từ 15-20 phút.
• Xông mặt:
  Nhỏ 2-5 giọt tinh dầu vào chậu nước nóng hoặc máy xông mặt, để cách mặt từ 25-30 cm. Nhắm mắt, hít sâu thư giãn liên tục khoảng 5-10 phút.

Chia sẻ

Chia sẻ

Công nghệ Hóa sinh và Protein

Rau tần hay húng chanh (Plectranthus amboinicus) là loại rau gia vị được sử dụng trong các món ăn. Lá cây rau tần có mùi thơm do có chứa hàm lượng tinh dầu lớn. Lá rau tần sau khi thu hoạch trên địa bàn Thừa Thiên Huế, được xử lý và chưng cất bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước để thu tinh dầu. Với thời gian chưng cất 2,5 giờ và tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 4/1 thu được hàm lượng tinh dầu cao nhất. Thành phần tinh dầu thu được sau khi phân tích định tính bằng phương pháp GC-MS cho thấy có chứa 19 thành phần hóa học. Khả năng kháng oxy hóa của tinh dầu cây rau tần được xác định bằng phương pháp DPPH. Kết quả cho thấy rằng, ở nồng độ 25 (μL/mL) sản phẩm này có khả năng kháng oxy hóa lớn nhất, đạt 62,66%. Sử dụng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch cho thấy tinh dầu rau tần thể hiện khả năng ức chế sự phát triển các chủng Salmonella và E. coli tốt nhất ở nồng độ 4% và 100%.

MỞ ĐẦU

Cây rau tần còn gọi là rau thơm lông, rau húng chanh, rau tần dày lá,… có tên khoa học là Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng, thuộc họ Hoa môi – Lamiaceae. Ngoài công dụng là một loại rau gia vị thông dụng trong ẩm thực của người châu Á, rau tần còn là loại cây thảo dược rất lâu đời trong y học dân gian, như trị bệnh cảm sốt, ho nhiệt, viêm họng, khan tiếng, côn trùng cắn…

Ngày nay, cây rau tần được trồng khắp nơi trên thế giới và rất phổ biến ở nước ta. Cây rau tần có hoạt tính kháng vi sinh vật cao (Rinalda et al., 2007), vì thế các chế phẩm rau tần ngày càng phong phú hơn, từ bài thuốc dân gian cổ điển cho đến thực phẩm chức năng, dược phẩm và mỹ phẩm.

Theo nghiên cứu của Lữ Thị Mộng Thy (2016) chỉ ra rằng lá rau tần được chiết xuất với điều kiện tối ưu thu được hàm lượng tinh dầu từ 0,03 – 0,12%. Ngoài ra, phân tích của GC/MS tác giả đã công bố rằng các thành phần hóa học chính của tinh dầu rau tần là carvacrol (63,29%), caryophyllene (12,39%), α – caryophyllene (2,05%), caryophyllene oxide (2,12%).

• Bên cạnh đó, cây rau tần còn chứa protein, carbohydrate, và một lượng nhỏ vitamin A, vitamin C. Nhiều hợp chất có giá trị sinh học trong rau tần được cho là có khả năng kháng oxy hóa, nhờ đó có thể ngăn ngừa các bệnh về tiêu hoá, ho, sốt và ung thư (Morais et al., 2007).

Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu (Nguyễn Thị Bích Huyền et al. (2012), Lữ Thị Mộng Thy (2016)) cũng chỉ ra rằng vùng nguyên liệu khác nhau ảnh hưởng rất lớn đến hàm lượng các hợp chất có giá trị sinh học trong rau tần, do đó ảnh hưởng lớn đến khả năng kháng oxy hóa và kháng khuẩn của dịch chiết.

Chính vì thế, nghiên cứu của chúng tôi tập trung vào việc xác định một số thông số tối ưu để khai thác tối đa hàm lượng tinh dầu có trong rau tần ở địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế. Từ đó, xác định thành phần chính của tinh dầu cây rau tần, cũng như khả năng kháng oxy hóa và kháng khuẩn của tinh dầu.

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Nguyên liệu

Lá rau tần được thu hái từ cây ra tần sau 3 tháng kể từ khi được trồng trên địa bàn Thừa Thiên Huế. Nguyên liệu được rửa sạch, để ráo và bảo quản ở tủ lạnh ở nhiệt độ 5 – 10°C để thực hiện các thí nghiệm chưng cất tinh dầu.

Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

• Nguyên liệu lá rau tần (Plectranthus amboinicus) sau khi được xử lý ở kích thước thích hợp được chưng cất thu tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước, sử dụng bộ chưng cất tinh dầu nhẹ Clevenger theo quy trình I của Dược Điển Việt Nam IV (2009).

Phương pháp định tính thành phần hóa học bằng sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS TQ8040

• Tinh dầu cây rau tần được định tính thành phần hóa học bằng máy sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS TQ8040 với detector MS tại phòng thí nghiệm thuộc Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc – Mỹ phẩm – Thực phẩm Thừa Thiên Huế.

Khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch của Kirby-Bauer (1961)

• Các chủng E. coli, Salmonella, Vibrio sp trước khi sử dụng được tăng sinh trên môi trường lỏng 1% pepton; 1% cao nấm men; 2% agar; nước cất, nuôi trong 12 giờ ở 37°C, lắc 100 vòng/phút.
• Huyền phù vi sinh vật đạt mật độ 106 CFU/mL được dùng trong thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn.

Phương pháp xử lý số liệu

Kết quả thí nghiệm được phân tích ANOVA và kiểm định Tukey (5%) để so sánh sự khác biệt về mặt thống kê giữa các giá trị trung bình. Các phân tích thống kê sử dụng phần mềm SPSS 20.

KẾT QUẢ

Sự ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/nguyên liệu và thời gian chưng cất đến lượng tinh dầu thu được

Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất và chất lượng tinh dầu thu được sau quá trình chưng cất.

Nguyên liệu (100 g) sau khi xử lý, tiến hành chưng cất với các tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w) khác nhau (3/1; 4/1; 5/1 và 6/1) thu được thể tích tinh dầu từ cây rau tần thu được cũng khác nhau lần lượt là: 13,37 (µL); 18,37 (µL); 18,33 (µL) và 17,27 (µL).

• Khi tăng lượng dung môi (nước cất) thì thể tích tinh dầu tăng, đạt cực đại (18,37 µL) tương ứng với tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 4/1.
• Nếu tiếp tục tăng lượng dung môi, thể tích tinh dầu thu được không tăng và có xu hướng giảm xuống dần.

Nhận xét:

Ở các mức thời gian khác nhau là 1 giờ; 1,5 giờ; 2 giờ; 2,5 giờ và 3 giờ thì thể tích tinh dầu thu được trên 100 g cũng khác nhau lần lượt là 6,83 (µL); 12,47 (µL); 18,37 (µL); 18,33 (µL) và 18,37 (µL).

Thời gian chưng cất càng lâu thể tích tinh dầu từ cây rau tần thu được càng tăng.

• Có thể nhận thấy, thể tích tinh dầu tăng dần theo thời gian chưng cất và lượng tinh dầu thu được cao nhất sau 2 giờ chưng cất (18,37 µL) và sau đó không tăng nữa.
• Lượng tinh dầu sau 2,5 giờ chưng cất (18,33 µL) và 3 giờ chưng cất (18,37 µL) không sai khác có ý nghĩa so với mẫu thí nghiệm 2 giờ (p<0,05).

==> Vì vậy, thời gian chưng cất thích hợp là 2 giờ với thể tích tinh dầu đạt 18,37 µL.

Phân tích định tính thành phần hóa học của tinh dầu cây rau tần

Tinh dầu cây rau tần được đưa vào máy sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS để phân tích thành phần định tính. Kết quả thu được phổ sắc ký theo hình 3 và thành phần tinh dầu được xác định bảng 1.

Bằng phương pháp GC/MS đã xác định được 19 thành phần hóa học. Trong đó, các thành phần chiếm hàm lượng cao là D – Verbenone (30,21%), cinnamyl alcohol (16,70%), trans – Caryophyllene (15,89%). Nghiên cứu chỉ ra rằng trans -Caryophyllene (chiếm tỷ 15,89%) là cao hơn so với nghiên cứu của Valer và đồng tác giả (2003) với trans -caryophyllene chỉ chiếm 9,1%.

Bên cạnh đó ở nghiên cứu của Nguyễn Thị Bích Huyền và đồng tác giả (2012), thành phần nổi bật trong tinh dầu rau tần được trồng ở huyện Thốt Nốt thành phố Cần Thơ là carvacrol (69%), cymene (9%) không có sự có mặt của d – verbenone và cinnamyl alcohol và trans – caryophyllene chỉ chiếm 4%.

• Theo Adinee và đồng tác giả (2008), những thành phần chính trong tinh dầu rau tần là tương đối khác so với kết quả nghiên cứu của công trình này. Theo đó, thành phần tinh dầu rau tần là trans – carveol 28,89%, citronellol 25,24%, gamma – 3 – cavene 5,26%.
• Trong khi đó, kết quả của Lữ Thị Mộng Thy (2016) cho thấy thành phần chính của tinh dầu rau tần là carvacrol (63,29%), caryophyllene (12,39%), anpha – caryophyllene (2,05%), caryophyllene oxide (2,12%).

Từ kết quả thu được ở công trình này so với các công trình khác cho thấy có sự khác biệt về thành phần hóa học của tinh dầu rau tần. Sự khác biệt này có thể là do sự khác nhau về phương pháp chưng cất, độ tuổi của cây, vị trí địa lý, khí hậu và điều kiện thổ nhưỡng.

Khả năng kháng oxy hóa của tinh dầu cây rau tần

Bảng 2 cho thấy phần trăm hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của tinh dầu rau tần được khảo sát ở các nồng độ khác nhau. Kết quả cho thấy, nếu tăng nồng độ từ 5 μL/mL đến 25 μL/mL thì giá trị SC% của tinh dầu tăng dần từ 45,848 % đến 62,656 %, chứng tỏ thể tích tinh dầu càng tăng thì khả năng kháng oxy hóa của tinh dầu càng cao.

Khả năng kháng oxy hóa thể hiện tốt nhất ở công thức 6 với khả năng bắt gốc tự do là 62,656 %. Khả năng kháng oxy hóa của tinh dầu rau tần tương đối cao (IC50= 9,19 μg/mL) và chỉ thấp hơn vitamin C (IC50 = 4,36 μg/mL) 2,1 lần.

• Theo nghiên cứu của Manjamalai và đồng tác giả (2012) đã công bố rằng tinh dầu rau tần thể hiện khả năng kháng oxy hóa đáng kể chống lại các tế bào ung thư phổi gây ra bởi dòng tế bào trong cả hai mô hình (in vitro và in vivo) có thể là do sự hiện diện của các hợp chất phytochemical như carvacrol và thymol.
• Alpha -Terpinene (1,72%), Gamma-Terpinene (1,02%) được công bố là có khả năng chống oxy hóa đáng kể (Brand et al., 2001). Các hợp chất này có thể ngăn chặn sự sản xuất superoxide và gốc tự do làm hư hại đến các thành phần của tế bào.

Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu cây rau tần

Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu cây rau tần được xác định dựa trên khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn, thể hiện qua đường kính vòng kháng khuẩn được tạo ra trên đĩa petri.

Kết quả bảng 3 chỉ ra rằng tinh dầu cây rau tần có khả năng kháng 2 chủng vi khuẩn E. coli và Salmonella. Mức độ kháng phụ thuộc vào nồng độ của tinh dầu sử dụng. Ngoài mẫu đối chứng không có khả năng kháng khuẩn ra thì các nồng độ còn lại đều ức chế được sự phát triển vi khuẩn.

• Ngay từ nồng độ pha loãng 0,5% đã xuất hiện vòng tròn kháng khuẩn tuy không lớn nhưng đã cho thấy được hai loại vi khuẩn đã bị ức chế ở nồng độ khảo sát nhỏ nhất. Đường kính đo được khá nhỏ với vòng kháng của E. coli đo được là 2,5 mm, với Salmonella đường kính vòng kháng đo được là 3,17 mm.
• Tuy nhiên, ở nồng độ cao hơn từ 1%, 2%, 4% thì vòng tròn kháng khuẩn đã có sự khác biệt rõ rệt. Ở nồng độ 1% đường kính vòng kháng khuẩn đối với E.coli là 6 mm với samonella là 7 mm và tăng dần ở các nồng độ 2%, 4% với đường kính vòng tròn kháng khuẩn lần lượt với E. coli là 8,5 mm, 13,5 mm và Samonella là 10 mm, 14 mm.

==> Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Hassani và đồng tác giả (2012) về khả năng kháng khuẩn của tinh dầu rau tần trên chủng gram (+) (S. aureus) và chủng gram (-) (E. coli). Điều này lý giải việc sử dụng cây rau tần như một vị thuốc trong dân gian để chữa một số bệnh như cảm lạnh, hen suyễn, ho, sốt…

KẾT LUẬN

• Nghiên cứu chỉ ra rằng hàm lượng tinh dầu của rau tần được trồng trên địa bàn Thừa Thiên Huế chiếm 1,83%. Trong đó gồm một số các hợp chất chính như D – Verbenone (30,21%), cinnamyl alcohol (16,70%), trans -Caryophyllene (15,89%).
• Thông số tối ưu của quá trình chưng cất thu tinh dầu là 2 giờ với tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 4/1. Bên cạnh đó, ở nồng độ 25 (μL/mL), tinh dầu rau tần có khả năng bắt gốc tự do là lớn nhất đạt 62,656a%.
• Tinh dầu rau tần thể hiện khả năng ức chế sự phát triển của 2 loài vi khuẩn khảo sát là E. coli, Salmonella tốt nhất ở nồng độ 100%.

Chia sẻ

Chia sẻ

Trương Minh Phụng, Lê Thị Thúy Hằng, Phạm Thị Hảo, Nguyễn Thị Huỳnh My, Nguyễn Hoàng Chương

MỞ ĐẦU

Các chất chuyển hóa thứ cấp có nguồn gốc từ Streptomyces có nhiều hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng phân bào, kháng nấm, ức chế miễn dịch, kháng côn trùng. Hai phần ba số thuốc kháng sinh đang sử dụng hiện nay ở người và động vật có nguồn gốc từ nhóm xạ khuẩn, điều này cho thấy tầm ứng dụng rất lớn của xạ khuẩn trong sản xuất các thuốc kháng khuẩn có nguồn gốc vi sinh vật [1].

Phần lớn các chủng xạ khuẩn cho đến nay được phân lập từ môi trường đất thuộc nhiều thành phần khác nhau, phần còn lại được phân lập từ môi trường biển, sông hồ và gần đây nhất là phân lập từ thực vật, đặc biệt là những thực vật được sử dụng như dược liệu trong các y học dân gian [2]. Các chủng vi sinh vật nội sinh, đặc biệt là Streptomyces chỉ mới được bắt đầu nghiên cứu mạnh trong những năm gần đây và cho thấy có tiềm năng lớn trong lĩnh vực sản sinh các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học [3]. Đặc biệt, có những giả thuyết về các chất có hoạt tính sinh học đã biết của các cây thuốc có nguồn gốc từ các vi sinh vật nội sinh của cây. Ngoài ra, còn có các giả thuyết có sự trao đổi gene giữa thực vật và các vi sinh vật nội sinh trong thực vật, trong đó có những gene liên quan đến việc tổng hợp các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học [2]. Như vậy, một kho tàng các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học từ các chủng vi sinh vật nội sinh nói chung và Streptomyces nội sinh nói riêng đang chờ được khám phá và khai thác. Điều này đặc biệt có ý nghĩa trong lĩnh vực kháng khuẩn khi hiện nay tình trạng vi khuẩn đề kháng kháng sinh trở nên nghiêm trọng và nhu cầu cho các kháng sinh mới là cấp thiết.

Ở Việt Nam, cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium) đã được sử dụng từ lâu trong dân gian để điều trị các loại bệnh khác nhau, đặc biệt là ung thư, bằng các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây. Có khả năng lớn là các chủng vi sinh vật nội sinh trong cây Trinh nữ hoàng cung cũng có khả năng sản sinh các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học quý.

Ngoài ra, một chất chuyển hóa thứ cấp có khả năng có nhiều hoạt tính sinh học cùng lúc như kháng khuẩn và kháng ung thư [4, 5]. Vì vậy, chúng tôi quyết định nghiên cứu phân lập các chủng xạ khuẩn nội sinh từ cây Trinh nữ hoàng cung và nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn từ các chủng xạ khuẩn này với hy vọng tìm ra các hợp chất kháng khuẩn mới nhằm đối phó với tình trạng kháng kháng sinh ở vi khuẩn như hiện nay.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

• Cây Trinh nữ hoàng cung được thu hái ngoài thiên nhiên.
• Các chủng vi sinh vật thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn được cung cấp bởi Trung tâm Nghiên cứu và Ứng dụng Sinh học. Các chủng vi sinh vật trong nghiên cứu này là các chủng vi sinh vật gây bệnh ở người và gồm hai nhóm: nhóm không kháng kháng sinh và nhóm kháng kháng sinh. Danh sách các vi sinh vật thử nghiệm được cung cấp chi tiết ở phần kết quả và thảo luận.

Phương pháp

Phân lập các chủng xạ khuẩn nội sinh từ cây Trinh nữ hoàng cung

• Sau khi được thu hái ngoài tự nhiên, phần thân, rễ, lá, củ của cây Trinh nữ hoàng cung được rửa sạch với nước máy để loại bỏ đất, cát.
• Sau đó, các bộ phận này được rửa tiếp tục với dung dịch Tween 20 1 % trong vài giây, tiếp theo sau là rửa với nước cất vô trùng.
• Các bộ phận này được rửa với dung dịch NaOCl 5 % trong 5 phút theo sau là bước rửa với dung dịch Na2S2O3 5 % trong 10 phút để trung hòa tác động của NaOCl.
• Bước kế tiếp là rửa các bộ phận của cây Trinh nữ hoàng cung với dung dịch ethanol 70 % trong 5 phút theo sau là rửa lại với nước vô trùng.
• Cuối cùng, rửa các bộ phận của cây bằng dung dịch NaHCO3 10 % trong 10 phút.

* Các bước thu nhận các chủng Streptomyces nội sinh từ thực vật được tham khảo công trình của Qin và cộng sự năm 2009 [6].

• Các bộ phận của cây sau khi xử lý vô trùng được nghiền nát trong nước muối sinh lý để giải phóng các vi sinh vật nội sinh.
• Dịch nghiền được trải trên môi trường SFM bổ sung nalidixic acid (30 µg/mL), cycloheximide (50 µg/mL) và nystatin (50 µg/mL).
• Ủ đĩa môi trường chứa dịch nghiền ở 28 oC trong 7 ngày.
• Tiến hành cấy chuyền làm thuần các khuẩn lạc đặc trưng cho nhóm xạ khuẩn và giữ bào tử của các chủng xạ khuẩn này trong dung dịch glycerol 30 % ở –20 oC.

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các chủng xạ khuẩn bằng phương pháp khuếch tán kháng sinh trên thạch

Cấy các chủng xạ khuẩn đã được làm thuần trong môi trường SFM lỏng và lắc ở nhiệt độ phòng trong 4 ngày.

• Sau 4 ngày, môi trường nuôi cấy được ly tâm để thu phần dịch nổi không chứa sinh khối xạ khuẩn.
• Cho 100 µL dịch nổi vào các lỗ đã được đục sẵn trên các đĩa môi trường MHA chứa các vi sinh vật thử nghiệm khác nhau.
• Sau đó, ủ các đĩa thạch thử nghiệm ở 37 oC qua đêm.

Tiến hành ghi nhận kết quả kháng khuẩn thông qua việc đo kích thước vòng vô khuẩn xuất hiện trên các mặt đĩa thạch chứa vi sinh vật thử nghiệm.

Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ trên hoạt tính kháng khuẩn của chủng xạ khuẩn nội sinh

• Chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn được nuôi cấy trong môi trường SFM lỏng ở 28oC và ở 37oC.
• Sau đó, tiến hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên thạch như trên.
• Ở mỗi nhiệt độ, thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

Khảo sát thời gian tổng hợp chất kháng khuẩn ở chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn

• Chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn được nuôi cấy trong môi trường SFM lỏng ở nhiệt độ phòng.
• Dịch nuôi cấy được trích ra ở các thời điểm 6h, 12 h, 18 h, 24 h, 30 h, 36 h, 42 h, 48 h kể từ thời điểm bắt đầu nuôi cấy.
• Các dịch vi khuẩn này được thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp đục lỗ như trên.
• Ở mỗi thời điểm khảo sát, thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy trên khả năng sinh chất kháng khuẩn của chủng xạ khuẩn

Chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn được cấy trong 6 loại môi trường lỏng khác nhau bao gồm:
SFM, FM3, SS, GSB, ISP1, ISP2.

• Sau 4 ngày nuôi cấy, các dịch môi trường nuôi cấy được thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp đục lỗ đã mô tả ở trên.
• Ở mỗi môi trường nuôi cấy, thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

Định danh phân tử chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn

Chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn được nuôi cấy trên môi trường SFM trong 4 ngày ở nhiệt độ phòng. Sau đó, thu nhận sinh khối xạ khuẩn và tách chiết DNA xạ khuẩn bằng phương pháp đun sôi.

• DNA này được sử dụng làm bản mẫu để nhân bản đoạn gene 16S rRNA với cặp primer 27F-1495R bằng phương pháp PCR. Sản phẩm PCR 16S rRNA được tinh sạch và giải trình tự nucleotide.
• Trình tự nucleotide 16S rRNA của SS004 được hiệu chỉnh bằng phần mềm BioEdit.
• Cây phát sinh chủng loại dựa trên 16S rRNA được xây dựng với phần mềm MEGA6.

Xử lý thống kê

Các kết quả kháng khuẩn biểu diễn bằng vòng kháng khuẩn xử lý bằng công cụ Excel với các công cụ tương ứng.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Kết quả phân lập chủng xạ khuẩn nội sinh từ cây Trinh nữ hoàng cung

Từ cây Trinh nữ hoàng cung, chúng tôi đã phân lập được ba chủng xạ khuẩn được ký hiệu lần lượt là SS004, SS005 và SS006. Các chủng xạ khuẩn sau phân lập được làm thuần trên môi trường SFM. Hình dạng ba chủng xạ khuẩn trên môi trường SFM [7] được trình bày trong Hình 1. Các khuẩn lạc có kích thước 2×2 cm trên Hình 1.

Nhận xét:

• Chủng SS004 được phân lập từ củ của cây Trinh nữ hoàng cung. Khuẩn lạc SS004 trên môi trường SFM có màu xám, rìa răng cưa, bào tử dạng phấn, bề mặt khô.
• Chủng SS005 được phân lập từ rễ của cây Trinh nữ hoàng cung. Khuẩn lạc SS5 trên môi trường SFM có màu xám trắng, mép tròn đều, bào tử dạng phấn, bề mặt khô.
• Chủng SS006 được phân lập từ rễ của cây Trinh nữ hoàng cung. Khuẩn lạc SS006 trên môi trường SFM có màu xám trắng, mép chia thùy, bào tử dạng phấn, bề mặt hơi ướt.

==> Tất cả các khuẩn lạc của SS004, SS005 và SS006 có hình dạng bên ngoài tương đồng với hình dạng đặc trưng của các chủng xạ khuẩn như có cấu tạo dạng sợi liên kết với nhau tạo thành khuẩn lạc với nhiều màu sắc khác nhau. Các sợi này được chia thành hai loại khác biệt là sợi cơ chất cắm sâu vào môi trường dinh dưỡng và sợi khí sinh hình thành nên bề mặt trên của xạ khuẩn và cũng là sợi phát sinh bào tử. Khuẩn lạc xạ khuẩn thường rắn chắc, xù xì, có thể có dạng da, dạng phấn, dạng nhung, dạng vôi tùy thuộc vào kích thước bào tử.

==> Khuẩn lạc thường có dạng phóng xạ. Như vậy, chúng tôi đã phân lập được ba chủng xạ khuẩn từ cây Trinh nữ hoàng cung và ba chủng này sẽ được khảo sát trong các thí nghiệm tiếp theo.

Kết quả khảo sát sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn

Ba chủng xạ khuẩn được khảo sát khả năng sinh hoạt chất kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên thạch. Các chủng vi sinh vật thử nghiệm hoạt tính bao gồm: Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteritica, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Candida albicans.

Các chủng vi sinh vật này đại diện cho nhóm vi khuẩn Gram âm, Gram dương, trực khuẩn, cầu khuẩn, xoắn khuẩn và vi nấm. Kết quả kháng khuẩn của ba chủng xạ khuẩn SS004, SS005, SS006 được trình bày trong Bảng 1.

Nhận xét:

• Kết quả ở Bảng 1 cho thấy chỉ có chủng xạ khuẩn SS004 thể hiện hoạt tính kháng khuẩn trên 4 trong số 8 vi sinh vật khảo sát. Điều này cho thấy hợp chất kháng khuẩn do SS004 sinh ra trên môi trường SFM có phổ hoạt tính rộng khi có tác dụng trên nhiều loại vi khuẩn khác nhau và với vi nấm Candida albicans.
• Hai chủng xạ khuẩn SS005 và SS006 không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn trên môi trường SFM.

==> Như vậy, SS004 là chủng xạ khuẩn tiềm năng sinh chất kháng khuẩn nên được chọn trong các nghiên cứu tiếp theo.

Định danh phân tử chủng xạ khuẩn

Để định danh phân tử chủng xạ khuẩn SS004, chúng tôi sử dụng phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại (phylogenetic tree trên gen 16S rRNA. DNA bộ gene tách chiết từ SS004 được nhân bản với cặp primer 27F-1495R [8] trong phản ứng PCR để thu nguyên liệu cho giải trình tự nucleotide. Kết quả PCR được trình bày trong Hình 2.

• Giếng 1: thang DNA 100 bp.
• Giếng 2: sản phẩm PCR trên DNA bộ gene SS004 với cặp primer 27F-1495R

Nhận xét:

• Kết quả điện di ở Hình 2 cho thấy đã thu được sản phẩm có kích thước khoảng 1,5 kb như mong đợi.
• Không có vạch sản phẩm ký sinh cho thấy phản ứng PCR có độ đặc hiệu cao. Sản phẩm PCR này được tinh sạch để giải trình tự nucleotide bằng phương pháp Sanger.

Chúng tôi thực hiện giải trình tự nucleotide sản phẩm PCR 16S rRNA từ SS004 theo hai chiều. Sau đó, hiệu chỉnh trình tự nucleotide đã giải dựa trên các tín hiệu huỳnh quang bằng phần mềm BioEdit kết hợp với so sánh dữ liệu 16S rRNA của các chủng xạ khuẩn trên GenBank.

Đoạn trình tự nucleotide của gene 16S rRNA của SS004 sau khi được giải và hiệu chỉnh sẽ được sử dụng để xây dựng cây phát sinh chủng loại ở bước tiếp theo. Để xây dựng cây phát sinh chủng loại nhằm định danh SS004, chúng tôi thu thập trình tự nucleotide 16S rRNA của hơn 1000 chủng xạ khuẩn trên GenBank.

• Các trình tự này được sử dụng cùng với trình tự 16S rRNA SS004 để xây dựng nên cây phát sinh chủng loại nhằm định danh phân tử chủng xạ khuẩn SS004. Phương pháp xây dựng cây phát sinh loài được tiến hành với phần mềm MEGA6. Kết quả định danh phân tử SS004 được trình bày trong Hình 3.

Nhận xét:

Kết quả từ cây phát sinh chủng loại cho thấy SS004 có sự tương đồng cao với chủng xạ khuẩn Streptomyces diastaticus subsp. ardesiacus với tỷ lệ bootstrap lên đến 96 %. Kết quả này khẳng định SS004 là xạ khuẩn.

Tuy nhiên để khẳng định SS004 có phải là Streptomyces diastaticus subsp. ardesiacus hay không thì cần thực hiện thêm các thí nghiệm khảo sát về mặt vi sinh, sinh hóa cũng như kết quả chụp hình dưới kính hiển vi điện tử.

Khảo sát thời gian sinh chất kháng khuẩn của chủng SS004

Để khảo sát thời điểm sinh chất kháng khuẩn, SS004 được nuôi cấy trong môi trường SFM lỏng.

Mẫu được thu tại các thời điểm 6 h, 12 h, 18 h, 24 h, 30 h, 36 h, 42 h, 48 h kể từ thời điểm bắt đầu nuôi cấy
và được khảo sát hoạt tính kháng khuẩn trên môi trường MHA. Kết quả được trình bày trong Hình 4.

Nhận xét:

Kết quả ở Hình 4 cho thấy SS004 bắt đầu sinh hợp chất kháng khuẩn sau 18h kể từ khi bắt đầu nuôi cấy và hợp chất kháng khuẩn đạt nồng độ bão hòa trong môi trường lỏng sau 30 h trở đi. Kết quả này chứng tỏ việc sinh chất kháng khuẩn được điều hòa biểu hiện ở chủng SS004.

Ở Streptomyces, các hợp chất kháng khuẩn thường do các nhóm gene (gene cluster) chịu trách nhiệm sinh tổng hợp và các gen trong nhóm chịu kiểm soát bởi các nhân tố bên trong lẫn bên ngoài cluster. Việc sinh hợp chất kháng khuẩn ở Streptomyces thường xảy ra ở giai đoạn sau của quá trình tăng trưởng khi có sự thay đổi về mặt hình dạng từ dạng khuẩn ty sơ cấp sang khuẩn ty thứ cấp và hình thành bào tử.

==> Kết quả này cần thiết cho nghiên cứu sinh tổng hợp và đặc biệt là điều hòa sinh tổng hợp chất kháng khuẩn ở SS004 sau này.

Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ trên khả năng sinh chất kháng khuẩn của chủng SS004

Nhiệt độ là một trong những nhân tố có ảnh hưởng đến sản sinh chất chuyển hóa thứ cấp ở Streptomyces. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên việc sinh chất kháng khuẩn của SS004 bằng cách nuôi cấy SS004 trong môi trường SFM được khảo sát ở hai nhiệt độ là 28 oC và 37 oC trong 4 ngày.

Dịch nuôi cấy được khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kết quả được trình bày ở Hình 5.

Nhận xét:

Kết quả cho thấy đường kính trung bình của vòng kháng khuẩn ở 28 oC là 15,7 mm là lớn hơn so với vòng kháng khuẩn ở 37 oC là 12,8 mm (P<0,05).

Các chủng vi khuẩn Streptomyces thường sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ trong khoảng 28–30 oC, vì vậy, khả năng sinh chất kháng khuẩn cũng có thể tối ưu trong khoảng nhiệt độ này so với nhiệt độ 37 oC, là nhiệt độ tối ưu cho nhiều loài vi khuẩn khác.

• Tuy nhiên, cũng có những trường hợp Streptomyces lại tăng cường sinh chất kháng khuẩn ở nhiệt độ 37 oC so với 28 oC như S. hygrocopicus sản sinh validamycin A. Trong trường hợp này, cơ chế tăng cường sản sinh chất kháng khuẩn ở nhiệt độ cao được giải thích do sự tăng cường chuyển hóa con đường pentose phosphate, tăng cường sinh tổng hợp protein và tăng cường mức độ phiên mã tổng quát dẫn đến tăng cường sinh tổng hợp validamycin A [9]. Hợp chất kháng khuẩn do SS004 sản sinh trong môi trường SFM không thuộc vào trường hợp được tăng cường tổng hợp ở nhiệt độ cao (37 oC) như S. hygroscopicus sinh validamycin A vừa kể trên.

==> Vì vậy, nhiệt độ 28 oC được chọn để lên men sinh tổng hợp chất kháng khuẩn ở SS004 trên môi trường SFM.

Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy trên khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của SS004

Các hợp chất dinh dưỡng có trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn ở Streptomyces. Trên thực tế, một chủng Streptomyces sản sinh ra các hợp chất kháng khuẩn khác nhau trên các môi trường nuôi cấy khác nhau.

Dựa trên cơ sở này, chúng tôi chọn một số môi trường nuôi cấy thường được sử dụng để lên men sinh chất kháng khuẩn ở Streptomyces nhằm khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy trên khả năng sinh chất kháng khuẩn của SS004. Các môi trường được sử dụng là SS [10], GSB [11], ISP1, ISP2 [12], FM3 [13], SFM.

==> Kết quả nghiên cứu đã khẳng định các thành phần có trong môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn ở Streptomyces. Cơ chế kích hoạt sản sinh hợp chất kháng khuẩn bằng môi trường chưa được tìm hiểu rõ ràng ở vi khuẩn, tuy nhiên có thể các thành phần khác nhau trong các môi trường hoạt động như các tín hiệu hóa học.

• Các tín hiệu này gắn vào các thụ thể tương ứng trong tế bào vi khuẩn dẫn đến sự thay đổi nồng độ Ca+, các hormon cảnh báo (alarmones), các gốc tự do (ROS) nội bào. Chính sự thay đổi về nồng độ các hợp chất này kiểm soát sự phiên mã các nhóm gene chịu trách nhiệm sinh tổng hợp các chất thứ cấp trực tiếp hoặc tác động thông qua các nhân tố kích hoạt phiên mã của các nhóm gen này [14].

KẾT LUẬN

1. Cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium) chứa các chủng Streptomyces nội sinh. Một trong các chủng Streptomyces này là SS004 cho thấy có khả năng kháng lại các vi sinh vật gây bệnh.

2. Thông qua định danh phân tử bằng 16S rRNA, SS004 có khả năng là Streptomyces diastaticus subsp. ardesiacus tuy nhiên cần thêm các phương pháp định danh khác để khẳng định. SS004 sinh hợp chất kháng khuẩn sau 18 h nuôi cấy trong môi trường SFM và nhiệt độ nuôi cấy có ảnh hưởng đến hàm lượng hợp chất kháng khuẩn sản sinh.

3. Đặc biệt khi thay đổi môi trường nuôi cấy, SS004 sản sinh những hợp chất kháng khuẩn mới có phổ rộng và kháng lại được những vi sinh vật đã kháng với các kháng sinh điều trị.

4. SS004 là chủng Streptomyces tiềm năng cho các nghiên cứu tiếp theovề khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn, đặc biệt hợp chất kháng khuẩn chống lại các chủng vi sinh vật gây bệnh kháng kháng sinh.

Lời cảm ơn:

• Nghiên cứu này được cung cấp kinh phí và vật liệu bởi Trung tâm Nghiên cứu và Ứng dụng

Chia sẻ

Chia sẻ

Tạp chí Khoa học và Phát triển 2015, tập 13, số 2: 245-250

Nghiên cứu được tiến hành nhằm xác định khả năng kháng khuẩn của tinh dầu lá tía tô đối với 8 chủng vi khuẩn gây hư hỏng và ngộ độc thực phẩm (Escherichia coli, Salmonella, P. fluorescens, P. aeruginosa VTCC-B-657, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Streptococcus feacium). Kết quả cho thấy tinh dầu lá tía tô có khả năng kháng khuẩn đối với tất cả các chủng vi khuẩn nghiên cứu ngoại trừ P. aeruginosa. Tác động của tinh dầu lá tía tô lên vi khuẩn gram dương mạnh hơn lên vi khuẩn gram âm.

1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong số hơn 550 loại cây có chứa tinh dầu ở nước ta thì tía tô là một trong những loại cây đang được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Lá tía tô chứa 0,3-1,3% lượng tinh dầu theo chất khô (Yu et al., 2010). Tinh dầu lá tía tô từ lâu đã được con người khai thác và sử dụng vào rất nhiều mục đích khác nhau. Loại  tinh dầu này chứa một số thành phần chủ yếu là perillaldehyde, limonene, á-pinene, â- caryophyllene, linalool và perilla alcohol,… (Đỗ Tất Lợi, 2003; Yu et al., 2010). Chúng được sử dụng trong y học, sản xuất nước hoa, các loại mỹ phẩm, phụ gia thực phẩm.

Hình ảnh cây Tía tô

Tinh dầu chiết xuất từ lá tía tô có tác dụng kháng khuẩn, chống ngộ độc cua cá, giảm triệu chứng trầm cảm, chống ung thư, giải cảm… Tinh dầu lá tía tô có tác dụng kháng khuẩn in vitro đối với các vi sinh vật. Tinh dầu lá tía tô có khả năng ngăn chặn các độc tố đường ruột và triệu chứng ngộ độc do Staphylococcus.

Cho đến nay đã có một số nghiên cứu trong nước về tinh dầu lá tía tô nhưng các tác giả mới chỉ tập trung vào việc xác định thành phần mà chưa có nghiên cứu nào được thực hiện về khả năng kháng khuẩn của tinh dầu lá tía tô. Mục tiêu của nghiên cứu này là xác định khả năng kháng khuẩn của tinh dầu lá tía tô Việt Nam, một loại rau thơm phổ biến của ẩm thực nước ta đồng thời là vị thuốc cổ truyền của y học Việt Nam.

2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

Tinh dầu lá tía tô (Perilla frutescens) được chưng cất từ nguyên liệu lá tía tô thu hái tại Vân Nội – Đông Anh vào thời điểm lúc cây ra hoa rộ.

• Các chủng vi khuẩn được sử dụng: Escherichia coli, Salmonella, P. fluorescens, P. aeruginosa VTCC-B-657, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Streptococcus feacium.
• Môi trường MHA (Mueller-Hilton Agar), xuất xứ Đức được dùng làm môi trường thử nghiệm. Thành phần môi trường: Infusion from meat 2 g/l, casein hydrolysate 17,5 g/l, NaCl 1,5 g/l, agar 17 g/l, pH (25oC) = 7,3 ± 0,2.
• Môi trường TSB (Trypticase Soy Broth) dùng làm môi trường tăng sinh vi khuẩn thử nghiệm. Thành phần môi trường: trypticase peptone 17 g/l, phytone peptone 3 g/l, NaCl 5 g/l, K2HPO4 2,5 g/l, glucose 2,5 g/l, pH (25oC) = 7,3 ± 0,2.

Phương pháp

Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu bằng phương pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn

– Chuẩn bị dịch vi khuẩn:

• Cấy ria tạo khuẩn lạc trên môi trường thạch MHA, vi khuẩn được tồn trữ trong ống thạch nghiêng và bảo quản lạnh ở 4oC.
• Từ ống tồn trữ, chọn 2-3 khuẩn lạc đưa vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường TSB đã khử trùng, nuôi cấy tĩnh ở 37oC (riêng P. fluorescens nuôi ở 30oC) trong 16 – 18h (riêng Staphylococcus aureus nuôi trong 24h).

Mật độ vi khuẩn sau khi nuôi cấy trong môi trường TSB được xác định theo phương pháp đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 625nm

– Tiến hành:

• Dùng pipet man hút 100µl vi khuẩn mỗi loại (mật độ tế bào 106 CFU/ml), sau đó chang đều trên mặt thạch MHA đã khô ổn định, chờ khô bề mặt.
• Đĩa giấy 6mm vô trùng được thấm bão hòa tinh dầu nguyên chất, dung dịch 5% tinh dầu và chờ khô rồi đặt lên mặt thạch đã chang vi khuẩn, đè nhẹ để đĩa giấy cố định trên mặt thạch.
• Đĩa giấy ở giữa thấm dung dịch đối chứng, các đĩa xung quanh thấm tinh dầu nguyên chất và dung dịch 5% .
• Chuyển các đĩa petri vào tủ lạnh (10oC) khoảng 4 – 8h để tinh dầu khuếch tán ra thạch. Sau đó đem nuôi ở 37oC trong 16 – 18h, riêng Staphylococcus aureus nuôi trong 24h, P. fluorescens nuôi ở 30oC/16 – 18h.
• Đọc kết quả và ghi nhận đường kính vòng vô khuẩn. Đường kính vòng vô khuẩn (D-d) được xác định bằng đường kính vòng kháng ngoài trừ đi đường kính đĩa giấy.

Xác định MIC(Minimum Inhibitory Concentration) theo phương pháp hòa tan trong môi trường lỏng TSB

• Pha dung dịch đối chứng và pha tinh dầu thành dãy nồng độ cần thử. Dãy nồng độ tinh dầu cần thử: 128 µg/ml, 256 µg/ml, 512 µg/ml, 1.024 µ g/ml, 2.048 µg/ml, 4.096 µg/ml, 8.192 µg/ml.
• Dùng pipet man hút tinh dầu đã pha loãng theo dãy nồng độ thử và dung dịch đối chứng vào các ống nghiệm đã chuẩn bị sẵn môi trường. Lắc đều cho tinh dầu và dung dịch đối chứng hòa tan đều vào môi trường.
• Dùng pipet man hút 20µl dịch vi khuẩn đã chuẩn bị đưa vào các ống nghiệm. Nuôi ở 37oC trong 16 – 18h, riêng Staphylococcus aureus nuôi trong 24h, P. fluorescens nuôi ở 30oC/16 – 18h.
• Đọc kết quả, tìm MIC của tinh dầu cho từng loại vi khuẩn.

Xử lý số liệu

Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên và được lặp lại 03 lần. Số liệu thí nghiệm thu được xử lý thống kê bằng phần mềm Excel 2007. Phân tích phương sai và so sánh các trung bình ở mức ý nghĩa á = 5% bằng phần mềm SAS 9.1.

3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu bằng phương pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn

Tinh dầu nguyên chất

Với thử nghiệm tinh dầu nguyên chất, kết quả cho thấy 5/8 chủng vi khuẩn khảo sát bị ức chế hoàn toàn (vi khuẩn không mọc trên toàn đĩa thạch).

• Điều này có thể được giải thích bởi khả năng khuếch tán khá mạnh của tinh dầu trên bề mặt thạch cùng với đặc tính dễ bay hơi của tinh dầu ở nhiệt độ thường, hơi của tinh dầu nguyên chất không thoát ra khỏi đĩa petri đã làm ức chế hoàn toàn sự phát triển của đa số các vi khuẩn khảo sát.

Các chủng Escherichia coli, Salmonella, P. aeruginosa mọc bình thường, tại những vị trí đặt đĩa giấy tẩm tinh dầu nguyên chất hình thành vòng kháng khuẩn, riêng P. aeruginosa không hình thành vòng kháng. Vòng kháng khuẩn đo được tương đối nhỏ và đồng đều nhau ở mỗi lần thử nghiệm, với Escherichia coli đường kính vòng kháng đo được là 5,26mm, với Salmonella đường kính vòng kháng đo được là 4,3mm.

Kết quả bước đầu cho thấy tác động của tinh dầu lên vi khuẩn gram dương mạnh hơn lên vi khuẩn gram âm.

• Tất cả các vi khuẩn gram dương bị ức chế hoàn toàn bởi tinh dầu lá tía tô nguyên chất (vi khuẩn không mọc trên toàn đĩa thạch).
• Điều này có thể được giải thích bởi sự khác nhau của thành tế bào của hai loại vi khuẩn gram âm và vi khuẩn gram dương . Thành tế bào gram dương gồm một lớp Peptidoglycan dày bao bên ngoài màng sinh chất (Plasma membrane).

Thành tế bào gram âm phức tạp hơn với lớp Peptidoglycan mỏng, cách một lớp không gian chu chất (Periplasmic space) và tới lớp màng ngoài (Outer membrane) là phức hợp lipoprotein và lipopolysaccharide. Chính cấu trúc nhiều lớp này đã bảo vệ tế bào vi khuẩn gram âm trước tác động của tinh dầu và khoảng không gian chu chất chứa độc tố và enzyme có thể làm mất tác dụng của tinh dầu trước khi tác dụng lên màng sinh chất. Kết quả của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của Yu và cộng sự (2010) về khả năng kháng khuẩn của tinh dầu lá tía tô trên một số chủng Staphylococcus aureus.

Tinh dầu 5%

Tiến hành thử nghiệm với dung dịch tinh dầu 5%, tất cả các chủng vi khuẩn nghiên cứu mọc bình thường và mọc đều trên mặt thạch.

Tại những chỗ đặt đĩa giấy tẩm dung dịch tinh dầu lá tía tô 5% không hình thành vòng kháng đối với 3/4 chủng vi khuẩn gram âm nghiên cứu, riêng P. fluorescens hình thành đường kính vòng kháng tương đối lớn là 9,58mm. Tất cả các chủng vi khuẩn gram dương nghiên cứu đều hình thành vòng kháng. Tuy nhiên đường kính đo được tương đối nhỏ nhưng đồng đều ở mỗi lần thử nghiệm.

• Đường kính vòng kháng khuẩn đối với Bacillus cereus là 4,43mm, Bacillus subtilis là 4,21mm, Streptococcus feacium là 5,2mm. Dung dịch tinh dầu 5% có tác dụng mạnh đối với Staphylococcus aureus, đường kính vòng kháng khuẩn đo được lớn nhất là 14,42mm.

Các kết quả trên đây cho thấy một lần nữa sự tác động của tinh dầu lá tía tô lên vi khuẩn gram âm và vi khuẩn gram dương là khác nhau. Tác động của tinh dầu lá tía tô 5% lên vi khuẩn gram dương mạnh hơn vi khuẩn gram âm.

Xác định MIC của tinh dầu tía tô

Chúng tôi tiến hành xác định MIC cho tất cả các chủng vi khuẩn nghiên cứu, loại trừ P. aeruginosa vì tinh dầu nguyên chất đã không kháng được. Kết quả chỉ có ý nghĩa khi ống nghiệm đối chứng vi khuẩn mọc bình thường.

Giá trị MIC của tinh dầu lá tía tô trên các chủng vi khuẩn nghiên cứu được thể hiện trên bảng 3 và bảng 4. Thông qua kết quả khảo sát có thể nhận thấy rằng MIC của tinh dầu lá tía tô đối với 2 chủng vi khuẩn gram âm là Escherichia coli và Salmonella > 8.192 µg/ml, với các chủng khác và cao hơn so với tinh dầu lá kinh giới.

• Riêng đối với Staphylococcus aureus, một loại vi khuẩn gram dương gây ngộ độc thực phẩm, chỉ cần một nồng độ tinh dầu lá tía tô khá thấp khoảng 1.024 µg/ml là có thể ức chế được. Các chủng còn lại có MIC từ 2.048 – 4.096 µg/m

4. KẾT LUẬN

Tinh dầu lá tía tô có khả năng kháng khuẩn đối với tất cả các chủng vi khuẩn nghiên cứu ngoại trừ P. aeruginosa. Tác động của tinh dầu lá tía tô lên vi khuẩn gram dương rõ hơn lên vi khuẩn gram âm. Tinh dầu nguyên chất ức chế hoàn toàn 4 chủng vi khuẩn gram dương nghiên cứu là Bacillus cereus, Bacillus subtilis,
Staphylococcus aureus, Streptococcus feaium (vi khuẩn không mọc trên toàn đĩa thạch) và chỉ ức chế hoàn toàn được 1 chủng vi khuẩn gram âm nghiên cứu là P. fluorescens.

Tinh dầu lá tía tô 5% ức chế mạnh các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, P. fluorescens với đường kính vòng kháng tương đối lớn lên đến 14,12mm và 9,58mm, trong khi đó lại có tác dụng kém hơn trên các chủng vi khuẩn Bacillus cereus, Bacillus subtilis và Streptococcus feaium với đường kính vòng kháng tương đối nhỏ.

Nồng độ tinh dầu tối thiểu ức chế sự phát triển của các chủng vi khuẩn nghiên cứu chủ yếu nằm trong dãy nồng độ tinh dầu thử nghiệm, từ 1.024 – 4.096 µg/ml. Riêng MIC của 2 chủng Escherichia coli và Salmonella là > 8.192 µg/ml, nằm ngoài dãy nồng độ thử nghiệm.

Chia sẻ

Chia sẻ

Tap chı́ Khoa hoc Trường Đai học Cần Thơ Phần A: Khoa học Tự nhiên, Công nghệ và Môi trường: 40 (2015): 1-6

Kết quả chứng minh hiệu quả kháng khuẩn của cao methanol cây Hà Thủ Ô rất cao ở giá trị MIC =16 µg/ml đối với 2 dòng vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus. Cao chiết methanol cây Hà Thủ Ô có khả năng kháng vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus cao hơn thuốc kháng sinh chuẩn ampicillin (MIC = 64 µg/ml) và amoxicillin (MICE. coli = 64 µg/ml và MICS. aureus = 16 µg/ml). Hiệu quả loại bỏ gốc tự do hydro ở DPPH của cao Hà Thủ Ô (IC50 = 349,35 µg/ml) thấp hơn so với vitamin C 15,5 lần (IC50 = 22,55 µg/ml).

GIỚI THIỆU

Cây Hà Thủ Ô trắng (Streptocaulon juventas Merr.) và các bộ phận của cây được các nhà khoa học quan tâm trong những năm gần đây. Các thử nghiệm về hoạt tính kháng ung thư cho thấy dịch chiết methanol rễ cây Hà Thủ Ô trắng có độc tính chọn lọc đối với năm dòng tế bào ung thư là tế bào ung thư tử cung Hela người, tế bào ung thư phổi người A549, tế bào ung thư chuột colon 26-L5, tế bào ung thư phổi chuột LLC và tế bào ung thư ruột kết chuột B16-BL6 chuột (Ueda et al., 2002). Dịch chiết của Hà Thủ Ô (cả cây) có khả năng kháng khuẩn (Quang-Vinh and Jong-Ban, 2013) và kháng oxy hóa (Quang-Vinh and Jong-Ban, 2011). Trong
nghiên cứu này, thành phần sử dụng của cây Hà Thủ Ô là thân và lá với mục đích khảo sát khả năng kháng khuẩn và kháng oxy hóa.

Hình ảnh cây Hà thủ ô trắng

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu

• Vật liệu thí nghiệm là cây Hà Thủ Ô trắng (Streptocaulon juventas Merr.) được thu hái ở Bến Tre. Cây Hà Thủ Ô sau khi thu mẫu được đem về phòng thí nghiệm và định danh theo Phạm Hoàng Hộ (2003).
• Các chủng vi khuẩn được sử dụng trong thử nghiệm bao gồm vi khuẩn Escherichia coli, Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa do Trung tâm kiểm nghiệm thuốc – mỹ phẩm – dược phẩm Cần Thơ cung cấp.

Phương pháp

Điều chế cao methanol cây Hà Thủ Ô

Bột thô thân và lá cây Hà Thủ Ô (500 g) được ngâm trong methanol 48 giờ, sau đó hỗn hợp được cô quay áp suất thấp, thu được cao methanol ở dạng sệt.

Khảo sát sự kháng khuẩn của cao methanol Hà Thủ Ô

Chuẩn bị cao chiết:

• Cao chiết được pha với dung môi methanol thành các nồng độ 8, 16, 32, 64, 128 µg/ml.
• Dịch nuôi vi khuẩn được pha loãng trong nước muối sinh lý tương đương độ đục ≥ 0,5 Mc Farland mật số vi khuẩn là 108 được trải đều trên môi trường LB đặc.
• Đĩa thạch được để khô 15 phút trước khi đặt khoanh giấy có tẩm cao Hà Thủ Ô.

Cao chiết Hà Thủ Ô ở các nồng độ khảo sát khác nhau (100 µl) được cho lên khoanh giấy (đường kính 6 mm) vô trùng.

Các kháng sinh ampicillin và amoxicillin được sử dụng như đối chứng dương và được pha thành các nồng độ tương tự như cao chiết.

Ngoài ra, do sử dụng methanol để pha cao chiết nên ảnh hưởng của methanol lên sự phát triển của vi khuẩn cũng được khảo sát. Mỗi đĩa thạch được đặt từ 1, 2 hay 3 khoanh giấy tẩm cao chiết, sau đó để khô.

• Các nồng độ 8, 16, 32, 64, 128 µg/ml được sử dụng trong khảo sát, mỗi nồng độ được lặp lại 3 lần.
• Các đĩa thạch được ủ ở 32ºC trong 24 – 48 giờ. Đường kính vùng ức chế được đo bằng thước đo đơn vị mm.

Khảo sát khả năng kháng oxy hóa DPPH

Khả năng kháng oxy hóa của cao chiết methanol cây Hà Thủ Ô trắng được thực hiện theo phương pháp DPPH (2,2 – Diphenyl – 1 – picrylhydrazyl) như sau:

• Cao methanol Hà Thủ Ô được pha thành các nồng độ 100, 200, 300, 400, 500 µg/ml trong methanol.
• Lượng cao chiết được pha vào phản ứng là 100 µl và DPPH 6×10-4 M là 100 µl (mỗi nồng độ lặp lại 3 lần).
• Hỗn hợp phản ứng được ủ trong 60 phút trong tối, sau đó được đo độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 517 nm.
• Khả năng kháng oxy hóa được tính dựa vào hiệu suất phản ứng và hàm lượng chất kháng oxy hóa tính tương đương vitamin C.

Thống kê phân tích số liệu

Kết quả được xử lý thống kê theo phương pháp phân tích Anova bằng phần mềm Minitab 16.0 và đồ thị được biểu diễn bằng phần mềm Microsoft Excel.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Điều chế cao methanol cây Hà Thủ Ô

Cao methanol cây Hà Thủ Ô sau khi cô quay thu được 20,04 g cao dạng sệt với hiệu suất chiết cao là 3,55% (so với trọng lượng khô).

Khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao methanol cây Hà Thủ Ô

Khả năng kháng khuẩn của cao Hà Thủ Ô được xác định dựa trên khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn thể hiện qua đường kính vòng kháng khuẩn được tạo ra trên đĩa petri được trình bày ở Hình 1 và Hình 2.

Kết quả mô tả ở Hình 1 cho thấy cao Hà Thủ Ô có khả năng kháng khuẩn đối với hai dòng vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus, đường kính vòng vô khuẩn được tạo ra ở nồng độ cao khảo sát rất thấp (< 16 μg/ml). Ngược lại, cao Hà Thủ Ô không có khả năng kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa (vẫn có vòng vô khuẩn nhưng khuẩn lạc phát triển khắp vòng Hình 1C).

Xét một cách tổng thể về khả năng kháng khuẩn của cao methanol Hà Thủ Ô đối với hai dòng vi khuẩn E. coli và S. aureus cho thấy cao Hà Thủ Ô có khả năng ức chế sự phát triển vi khuẩn E.coli cao hơn vi khuẩn S. aureus một cách khác biệt có ý nghĩa thống kê ở nồng độ khảo sát từ 16 μg/ml đến 128 μg/ml

Hiệu quả kháng khuẩn của cao Hà Thủ Ô đối với chủng vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus trình bày ở Bảng 1.

Kết quả cho thấy đường kính vòng kháng khuẩn tỉ lệ thuận với nồng độ cao Hà Thủ Ô; nghĩa là khả năng kháng khuẩn của cao Hà Thủ Ô tăng khi tăng nồng độ cao chiết.

• Hiệu quả kháng khuẩn của cao Hà Thủ Ô đối với chủng vi khuẩn E. coli cao hơn khác biệt có ý nghĩa thống kê so với vi khuẩn S. aureus ở tất cả các nồng độ khảo sát (Bảng 1).
• So sánh về độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh thì vi khuẩn E. coli và S. aureus nhạy cảm với cao Hà Thủ Ô hơn so với kháng sinh ampicillin. Ở nồng độ 16 µg/ml, cao Hà Thủ Ô có hoạt tính ức chế cao với 2 chủng vi khuẩn E. coli và S. aureus tạo vòng vô khuẩn rõ rệt, lần lượt là 25,3 ± 0,6 mm và 22,7 ± 0,6 mm (Bảng 1), trong khi đó kháng sinh ampicillin không ức chế hai dòng vi khuẩn này ở nồng độ 16 µg/ml (Hình 3). Sự nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh là rất quan trọng để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn.

Trong nghiên cứu này cho thấy hai dòng vi khuẩn khảo sát đều nhạy cảm với cao Hà Thủ Ô, điều này chứng minh rằng các thảo dược có thể thay thế các kháng sinh thương mại nhưng mức độ an toàn cao hơn.

So sánh khả năng kháng khuẩn của cao methanol Hà Thủ Ô với thuốc kháng sinh thương mại được sử dụng là ampicillin và amoxicillin được trình bày ở Hình 3.

• Biểu đồ trình bày ở Hình 3A cho thấy, khả năng kháng vi khuẩn E. coli của cao Hà Thủ Ô cao hơn so với hai loại kháng sinh chuẩn amipicillin và amoxicillin ở tất cả nồng độ khảo sát.
• Biểu đồ trình bày ở Hình 3B cho thấy, khả năng kháng vi khuẩn S. aureus của cao Hà Thủ Ô cao hơn kháng sinh ampicillin ở tất cả nồng độ khảo sát.
• Tuy nhiên, cao Hà Thủ Ô có khả năng kháng vi khuẩn S. aureus thấp hơn kháng sinh amoxcillin khi khảo sát ở nồng độ từ 32 µg/ml đến 128 µg/ml.

Khả năng kháng khuẩn của cao Hà Thủ Ô được xác định dựa trên giá trị MIC (minimum inhibitory concentration).

Nồng độ ức chế tối thiểu là nồng độ cao chiết (hoặc kháng sinh) thấp nhất mà tại đó xuất hiện vòng vô khuẩn; nên nồng độ ức chế tối thiểu càng thấp thì khả năng kháng khuẩn càng cao. Ta thấy, nồng độ ức chế tối thiểu của cao Hà Thủ Ô ở hai chủng vi khuẩn E. coli và S. aureus bằng nhau và bằng 16 µg/ml, cao Hà Thủ Ô không có tác dụng kháng vi khuẩn P. aeruginosa. Khả năng kháng hai chủng vi khuẩn E. coli và S. aureus của ampicillin (MIC = 64 µg/ml) thấp hơn so với cao Hà Thủ Ô (MIC = 16 µg/ml).

Kháng sinh ampicillin có khả năng kháng P. aeruginosa (MIC = 64 µg/ml), trong khi cao Hà Thủ Ô không có khả năng kháng chủng vi khuẩn này. Kháng sinh amoxicillin có khả năng kháng khuẩn trên ba dòng vi khuẩn khảo sát là E. coli, S. aureus và P.aeruginosa với giá trị MIC lần lượt là 64 µg/ml, 16 µg/ml và 64 µg/ml.

• Kết quả cho thấy, khả năng kháng vi khuẩn E. coli và S. aureus của cao Hà Thủ Ô (MIC = 16 µg/ml) cao
  hơn kháng sinh amoxicillin.
• Kết quả có thể chứng minh khả năng kháng khuẩn của cao Hà Thủ Ô cao hơn gấp 4 lần so với kháng sinh ampicillin trên hai dòng vi khuẩn E. coli và S. aureus.
• Cao methanol cây Hà Thủ Ô có hiệu quả kháng vi khuẩn E. coli cao gấp 4 lần so với kháng sinh amoxicillin.
• Hiệu quả kháng vi khuẩn S. aureus của cao Hà Thủ Ô tương đương với kháng sinh amoxicillin.

Khảo sát khả năng làm sạch gốc tự do DPPH của cao chiết cây Hà Thủ Ô

Khả năng kháng oxy hóa của cao Hà Thủ Ô được khảo sát dựa trên hàm lượng chất kháng oxy hóa. Hàm lượng chất kháng oxy hóa được tính tương đương µg/ml vitamin C dựa vào phương trình đường chuẩn y = -0,029x + 1,3311 (R2 = 0,9897).

Kết quả kháng oxy hóa của cao methanol cây Hà Thủ Ô được trình bày trong Bảng 3 cho thấy, hiệu suất kháng oxy hóa của cao Hà Thủ Ô tỉ lệ thuận với nồng độ cao và khác biệt có ý nghĩa thống kê ở các nồng độ khảo sát. Hiệu suất kháng oxy hóa của cao Hà Thủ Ô cao nhất là 72,07% ở nồng độ 500 µg/ml.

Kết quả hàm lượng chất kháng oxy hóa có trong cao Hà Thủ Ô được tính dựa vào phương trình đường chuẩn viatmin C (y = -0,029x + 1,3311) được trình bày ở  Bảng 3.

• Kết quả trình bày ở Bảng 3 cho thấy, nồng độ cao từ 0 đến 500 µg/ml có lượng vitamin C tương ứng tăng dần từ 0 đến 33,15 ± 0,86 µg/ml.
• Nồng độ cao methanol Hà Thủ Ô cao nhất 500 µg/ml tương ứng với 33,15 ± 0,86 µg/ml vitamin C và 100 µg/ml là nồng độ thấp nhất với lượng vitamin C tương ứng 9,8 ± 0,52 µg/ml.

Kết quả nghiên cứu này chứng minh cao Hà Thủ Ô có khả năng kháng oxy hóa cao hơn một số thảo dược trong các nghiên cứu trước đây như cây Nhàu (Morinda citrifolia L.) gồm cao ethanol lá, trái xanh, rễ cây Nhàu với giá trị IC50 lần lượt là 917,16 µg/ml, 1025,2 µg/ml và 1531,4 µg/ml (Đái Thị Xuân Trang và ctv, 2012); cây Cà gai leo (Solanum hainanense Hance) IC50 là 1734 µg/ml và cao Hà Thủ Ô (Streptocaulon juventas Merr.) (cả cây) có khả năng kháng oxy hóa với giá trị là IC50 = 2586 µg/ml (Quang- Vinh and Jong-Ban, 2011).

KẾT LUẬN

• Cao methanol Hà Thủ Ô trắng (thân và lá) có khả năng kháng hai loại vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus cao hơn thuốc kháng sinh thương mại ampicillin và amoxicillin.
• Cao methanol Hà Thủ Ô trắng không có khả năng kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa ở các nồng độ khảo sát.
• Cao methanol Hà Thủ Ô có khả năng kháng oxy hóa trong phương pháp DPPH với giá trị IC50 = 349 µg/ml thấp hơn vitamin C (IC50 = 22,55 µg/ml) 15,5 lần.

Chia sẻ

Chia sẻ

Mở đầu

Dứa dại (tên khoa học là Pandanus tectorius Sol.) là loại cây mọc khá phổ biến ở các vùng ven biển châu Á có giá trị về mặt kinh tế như sản xuất công nghiệp, tiểu thủ công nghiệp, bảo vệ môi trường, điều trị bệnh…[2].

Trong Đông y, rễ non cây dứa dại thường được dùng để chữa phù thũng, viêm đường tiết niệu, sỏi thận, đau đầu, mất ngủ, ăn uống kém sau sinh; và lá cây dứa dại thường được dùng để điều trị các vết loét sâu, lở loét lâu ngày, tiểu ra máu…

Cho đến nay trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu được công bố về thành phần hóa học cũng như công dụng trong y học của cây dứa dại. Tuy nhiên, ở Việt Nam việc nghiên cứu và khai thác dứa dại còn rất hạn chế.

Dứa dại có mặt gần như trên toàn bộ lãnh thổ nước ta, đặc biệt ở Hội An cây dứa dại sinh trưởng mạnh mẽ, mọc hoang rất nhiều. Vì vậy, vấn đề nghiên cứu một cách đồng bộ, lâu dài để có quy hoạch khai thác và sử dụng dứa dại có hiệu quả cần được quan tâm.

Nghiên cứu thực nghiệm

Nguyên liệu

Lá và rễ non cây của cây dứa dại được thu hái ở Hội An, Quảng Nam, đem tách bỏ những phần hư hại, rửa sạch, cắt nhỏ. Sau đó tiến hành sấy nguyên liệu bằng tủ sấy ở nhiệt độ 300- 400C rồi xay nhỏ.

Phương pháp chiết

Phương pháp được sử dụng để thu dịch chiết là phương pháp chiết soxhlet. Nguyên liệu được chiết lần lượt qua các dung môi có độ phân cực khác nhau: hexane, dichloromethane, ethyl acetate, methanol.

Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố thời gian chiết đến quá trình chiết

• Lấy 5 mẫu, mỗi mẫu 10g nguyên liệu.
• Tiến hành chiết soxhlet với 150ml dung môi hexane ở các khoảng thời gian là 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ và 12 giờ đối với lá cây dứa dại và 8 giờ, 10 giờ, 12 giờ, 14 giờ, 16 giờ đối với rễ non cây dứa dại.
• Dịch chiết đem cô đuổi dung môi.
• Cân khối lượng cao thu được.
• Tiến hành tương tự như trên với các dung môi dichloromethane và ethyl acetate.

Xác định thành phần hóa học các dịch chiết

• Thành phần hoá học các dịch chiết hexane, dịch chiết dichloromethane và dịch chiết ethyl acetate của lá, rễ non cây dứa dại được xác định bằng hệ thống sắc ký khí khối phổ7890A/5975C, Agilent technology, Mỹ; cột tách mao quản HP – 5MS (5% Phenyl Methyl Silox): 3m x 250μm x 0,25μm
• Các cao chiết methanol của lá và rễ non cây được thử hoạt tính kháng sinh tại phòng Hóa sinh ứng dụng, Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Kết quả và thảo luận

Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố thời gian chiết đến quá trình chiết bằng phương pháp chiết soxhlet

Đối với nguyên liệu lá dứa dại

Thời gian chiết thích hợp 10g bột lá cây dứa dại và khối lượng cao chiết thu được khi chiết với dung môi hexane, dichloromethane và ethyl acetate lần lượt là 8 giờ (0,771g), 10 giờ (1,421g) và 8 giờ (1,080g).

Đối với nguyên liệu rễ non cây dứa dại

Thời gian chiết thích hợp 10g rễ non cây dứa dại và khối lượng cao chiết thu được khi chiết vớidung môi hexane, dichloromethane và ethyl acetate lần lượt là 12 giờ (1,473g), 12 giờ (0,430g) và 14 giờ (0,662g).

Thành phần hóa học của các dịch chiết lá dứa dại trong các dung môi hữu cơ

Thành phần hóa học dịch chiết lá dứa dại trong các dung môi hữu cơ

Kết quả định danh bằng phương pháp GC-MS cho thấy trong dịch chiết lá cây dứa dại trong các dung môi hữu cơ có 24 cấu tử được định danh.

Trong đó số cấu tử được định danh của dịch chiết hexane, dichloromethane và ethyl acetate lần lượt là 15 cấu tử, 21 cấu tử và 17 cấu tử. Kết quả định danh bằng phương pháp GC-MS trong một số dịch chiết từ lá dứa dại được tổng hợp ở Bảng 1.

Kết quả ở Bảng 1 cho thấy:

• Dung môi có nhiều cấu tử được định danh nhiều nhất là dichloromethane và ít nhất là hexane.
• Dịch chiết dichloromethane và ethyl acetate có nhiều cấu tử giống nhau. Trong đó, Benzofuran,6 – ethenyl – 4,5,6,7 – tetrahydro – 3,6 –dimethyl-5- isopenyl,trans có mặt ở cả 3 dịch chiết với hàm lượng cao. Nó là chất kháng nấm và kháng oxi hóa rất tốt, đã được ứng dụng trong điều trị tăng tuần hoàn máu và ngăn ngừa tiền ung thư vú. Gamma-Elemene là chất có hoạt tính chống tăng sinh tế bào ung thư và kháng khuẩn rất cao.
• Hai loại acid béo là n-hexadecanoic acid và 9,12,15-octadecatrienoic acid. Hai acid này có khả năng kháng ung thư rất cao và còn được sử dụng trong một số dạng sữa thành phẩm giảm béo phì. Đồng thời nó còn tăng khả năng hấp thụ các loại vitamin A,E… bảo vệ collagen trong da, giảm tính viêm sưng [1].
• Trong thành phần dịch chiết dichloromethane có chứa Squalene, chất này gần đây gần đây được sử dụng như là một chất bổ trợ miễn dịch vắc xin, có tác dụng ngăn ngừa ung thư bằng cách loại bỏ các tế bào gây hại.

Thành phần hóa học dịch chiết rễ non cây dứa dại trong các dung môi hữu cơ

Kết quả định danh bằng phương pháp GC-MS cho thấy trong dịch chiết rễ non cây dứa dại trong các dung môi hữu cơ có 24 cấu tử được định danh. Trong đó số cấu tử được định danh của dịch chiết hexane, dichloromethane và ethyl acetate lần lượt là 15 cấu tử, 7 cấu tử và 19 cấu tử. Kết quả định danh bằng phương pháp GC-MS trong một số dịch chiết từ rễ non cây dứa dại được tổng hợp ở Bảng 2.

Kết quả từ Bảng 2 cho thấy

• Dịch chiết rễ non cây dứa dại trong dung môi hexane có nhiều cấu tử được định danh nhất, trong khi đó dịch chiết hexane của lá cây dứa dại số cấu tử định danh được lại là ít nhất.
• Tổng số cấu tử định danh được từ dịch chiết lá cũng như rễ non cây dứa dại đều là 24 cấu tử. Nhìn chung, dịch chiết từ lá và rễ non cây dứa dại trong các dung môi có nhiều cấu tử được định danh giống nhau.
• Đáng lưu ý là trong dịch chiết hexane của rễ non cây dứa dại cấu tử Artumerone có hàm lượng cao nhất, chiếm đến 32,52%. Ar-tumerone có ý nghĩa lớn trong y học. Chất này gây ức chế sự kích hoạt thần kinh đệm, sở hữu đặc tính kháng viêm do sự phong tỏa các con đường tín hiệu quan trọng trong tiểu thần kinh đệm, tạo thành một tác nhân điều trị đầy hứa hẹn cho các triệu chứng rối loạn thần kinh khác nhau [1].

Kết quả thử hoạt tính sinh học các cao chiết methanol của lá và rễ non cây dứa dại

Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết methanol được thể hiện ở Bảng 3.

Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết methanol cho thấy

• Các cao chiết methanol của lá và rễ non cây dứa dại thể hiện hoạt tính ức chế đặc hiệu với sự phát triển của chủng vi sinh vật Gram (+) Staphylococcus aureus và Bacillus subtilis với giá trị IC50 lần lượt là 80,0µg/ml, 26,0µg/ml đối với lá dứa dại và 88,47µg/ml, 40,73µg/ml đối với rễ non cây dứa dại.
• Như vậy, với khả năng ức chế được các dòng vi sinh vật này thì cao chiết methanol có thể dùng để nghiên cứu điều trị các bệnh do 2 chủng vi sinh vật này gây ra như bệnh ngoài da, bệnh đường hô hấp, nhiễm trùng… phù hợp với ứng dụng chữa bệnh của rễ non và lá cây dứa dại trong Đông y.
• Tuy nhiên, các cao chiết methanol của lá và rễ non cây dứa dại lại không thể hiện hoạt tính đối vớicác chủng vi khuẩn Gram (-) và nấm ở nồng độ IC50< 128µg/ml.

Kết luận

Nghiên cứu đã đạt được một số kết quả như sau:

– Thời gian chiết thích hợp 10g bột lá cây dứa dại và khối lượng cao chiết thu được khi chiết với dung môi hexane, dichloromethane và ethyl acetate lần lượt là 8 giờ (0,771g), 10 giờ (1,421g) và 8 giờ (1,080g).

– Thời gian chiết thích hợp 10g rễ non cây dứa dại và khối lượng cao chiết thu được khi chiết với dung môi hexane, dichloromethane và ethyl acetate lần lượt là 12 giờ (1,473g), 12 giờ (0,430g) và 14 giờ (0,662g).

– Bằng phương pháp GC-MS đã định danh được 24 cấu tử trong dịch chiết lá cây dứa dại trong các dung môi hữu cơ. Trong đó số cấu tử được định danh của dịch chiết hexane, dichloromethane và ethyl acetate lần lượt là 15 cấu tử, 21 cấu tử và 17 cấu tử. Trong dịch chiết rễ non cây dứa dại trong các dung môi hữu cơ có 24 cấu tử được định danh. Trong đó số cấu tử được định danh của dịch chiết hexane, dichloromethane và ethyl acetate lần lượt là 15 cấu tử, 7 cấu tử và 19 cấu tử.

– Cao chiết methanol của lá và rễ non cây dứa dại thể hiện hoạt tính ức chế đặc hiệu với sự phát triển của chủng vi sinh vật Gram (+) Staphylococcus aureus và Bacillus subtilis với giá trị IC50 lần lượt là 80,0µg/ml, 26,0µg/ml đối với lá dứa dại và 88,47µg/ml, 40,73µg/ml đối với rễ non cây dứa dại.

Các cấu tử được định trong lá và rễ non cây dứa dại hầu hết đều có hoạt tính sinh học mạnh, chống tăng sinh tế bào ung thư, kháng khuẩn, kháng viêm… Điều đó đã minh chứng một cách khoa học cho việc sử dụng cây dứa dại để chữa bệnh trong dân gian từ trước đến nay.

Nguồn: Phùng Thị Ái Hữu, Bùi Ngọc Phương Châu, Đào Hùng Cường (2016), Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học trong một số dịch chiết của lá và rễ non cây dứa dại ở Hội An, Tạp chí Khoa học Xã hội, Nhân văn & Giáo dục, Tập 6(1), tr. 5-9.

Chia sẻ

Chia sẻ