Công nghệ Hóa sinh và Protein

Rau tần hay húng chanh (Plectranthus amboinicus) là loại rau gia vị được sử dụng trong các món ăn. Lá cây rau tần có mùi thơm do có chứa hàm lượng tinh dầu lớn. Lá rau tần sau khi thu hoạch trên địa bàn Thừa Thiên Huế, được xử lý và chưng cất bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước để thu tinh dầu. Với thời gian chưng cất 2,5 giờ và tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 4/1 thu được hàm lượng tinh dầu cao nhất. Thành phần tinh dầu thu được sau khi phân tích định tính bằng phương pháp GC-MS cho thấy có chứa 19 thành phần hóa học. Khả năng kháng oxy hóa của tinh dầu cây rau tần được xác định bằng phương pháp DPPH. Kết quả cho thấy rằng, ở nồng độ 25 (μL/mL) sản phẩm này có khả năng kháng oxy hóa lớn nhất, đạt 62,66%. Sử dụng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch cho thấy tinh dầu rau tần thể hiện khả năng ức chế sự phát triển các chủng Salmonella và E. coli tốt nhất ở nồng độ 4% và 100%.

MỞ ĐẦU

Cây rau tần còn gọi là rau thơm lông, rau húng chanh, rau tần dày lá,… có tên khoa học là Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng, thuộc họ Hoa môi – Lamiaceae. Ngoài công dụng là một loại rau gia vị thông dụng trong ẩm thực của người châu Á, rau tần còn là loại cây thảo dược rất lâu đời trong y học dân gian, như trị bệnh cảm sốt, ho nhiệt, viêm họng, khan tiếng, côn trùng cắn…

Ngày nay, cây rau tần được trồng khắp nơi trên thế giới và rất phổ biến ở nước ta. Cây rau tần có hoạt tính kháng vi sinh vật cao (Rinalda et al., 2007), vì thế các chế phẩm rau tần ngày càng phong phú hơn, từ bài thuốc dân gian cổ điển cho đến thực phẩm chức năng, dược phẩm và mỹ phẩm.

Theo nghiên cứu của Lữ Thị Mộng Thy (2016) chỉ ra rằng lá rau tần được chiết xuất với điều kiện tối ưu thu được hàm lượng tinh dầu từ 0,03 – 0,12%. Ngoài ra, phân tích của GC/MS tác giả đã công bố rằng các thành phần hóa học chính của tinh dầu rau tần là carvacrol (63,29%), caryophyllene (12,39%), α – caryophyllene (2,05%), caryophyllene oxide (2,12%).

• Bên cạnh đó, cây rau tần còn chứa protein, carbohydrate, và một lượng nhỏ vitamin A, vitamin C. Nhiều hợp chất có giá trị sinh học trong rau tần được cho là có khả năng kháng oxy hóa, nhờ đó có thể ngăn ngừa các bệnh về tiêu hoá, ho, sốt và ung thư (Morais et al., 2007).

Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu (Nguyễn Thị Bích Huyền et al. (2012), Lữ Thị Mộng Thy (2016)) cũng chỉ ra rằng vùng nguyên liệu khác nhau ảnh hưởng rất lớn đến hàm lượng các hợp chất có giá trị sinh học trong rau tần, do đó ảnh hưởng lớn đến khả năng kháng oxy hóa và kháng khuẩn của dịch chiết.

Chính vì thế, nghiên cứu của chúng tôi tập trung vào việc xác định một số thông số tối ưu để khai thác tối đa hàm lượng tinh dầu có trong rau tần ở địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế. Từ đó, xác định thành phần chính của tinh dầu cây rau tần, cũng như khả năng kháng oxy hóa và kháng khuẩn của tinh dầu.

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Nguyên liệu

Lá rau tần được thu hái từ cây ra tần sau 3 tháng kể từ khi được trồng trên địa bàn Thừa Thiên Huế. Nguyên liệu được rửa sạch, để ráo và bảo quản ở tủ lạnh ở nhiệt độ 5 – 10°C để thực hiện các thí nghiệm chưng cất tinh dầu.

Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

• Nguyên liệu lá rau tần (Plectranthus amboinicus) sau khi được xử lý ở kích thước thích hợp được chưng cất thu tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước, sử dụng bộ chưng cất tinh dầu nhẹ Clevenger theo quy trình I của Dược Điển Việt Nam IV (2009).

Phương pháp định tính thành phần hóa học bằng sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS TQ8040

• Tinh dầu cây rau tần được định tính thành phần hóa học bằng máy sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS TQ8040 với detector MS tại phòng thí nghiệm thuộc Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc – Mỹ phẩm – Thực phẩm Thừa Thiên Huế.

Khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch của Kirby-Bauer (1961)

• Các chủng E. coli, Salmonella, Vibrio sp trước khi sử dụng được tăng sinh trên môi trường lỏng 1% pepton; 1% cao nấm men; 2% agar; nước cất, nuôi trong 12 giờ ở 37°C, lắc 100 vòng/phút.
• Huyền phù vi sinh vật đạt mật độ 106 CFU/mL được dùng trong thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn.

Phương pháp xử lý số liệu

Kết quả thí nghiệm được phân tích ANOVA và kiểm định Tukey (5%) để so sánh sự khác biệt về mặt thống kê giữa các giá trị trung bình. Các phân tích thống kê sử dụng phần mềm SPSS 20.

KẾT QUẢ

Sự ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/nguyên liệu và thời gian chưng cất đến lượng tinh dầu thu được

Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất và chất lượng tinh dầu thu được sau quá trình chưng cất.

Nguyên liệu (100 g) sau khi xử lý, tiến hành chưng cất với các tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w) khác nhau (3/1; 4/1; 5/1 và 6/1) thu được thể tích tinh dầu từ cây rau tần thu được cũng khác nhau lần lượt là: 13,37 (µL); 18,37 (µL); 18,33 (µL) và 17,27 (µL).

• Khi tăng lượng dung môi (nước cất) thì thể tích tinh dầu tăng, đạt cực đại (18,37 µL) tương ứng với tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 4/1.
• Nếu tiếp tục tăng lượng dung môi, thể tích tinh dầu thu được không tăng và có xu hướng giảm xuống dần.

Nhận xét:

Ở các mức thời gian khác nhau là 1 giờ; 1,5 giờ; 2 giờ; 2,5 giờ và 3 giờ thì thể tích tinh dầu thu được trên 100 g cũng khác nhau lần lượt là 6,83 (µL); 12,47 (µL); 18,37 (µL); 18,33 (µL) và 18,37 (µL).

Thời gian chưng cất càng lâu thể tích tinh dầu từ cây rau tần thu được càng tăng.

• Có thể nhận thấy, thể tích tinh dầu tăng dần theo thời gian chưng cất và lượng tinh dầu thu được cao nhất sau 2 giờ chưng cất (18,37 µL) và sau đó không tăng nữa.
• Lượng tinh dầu sau 2,5 giờ chưng cất (18,33 µL) và 3 giờ chưng cất (18,37 µL) không sai khác có ý nghĩa so với mẫu thí nghiệm 2 giờ (p<0,05).

==> Vì vậy, thời gian chưng cất thích hợp là 2 giờ với thể tích tinh dầu đạt 18,37 µL.

Phân tích định tính thành phần hóa học của tinh dầu cây rau tần

Tinh dầu cây rau tần được đưa vào máy sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS để phân tích thành phần định tính. Kết quả thu được phổ sắc ký theo hình 3 và thành phần tinh dầu được xác định bảng 1.

Bằng phương pháp GC/MS đã xác định được 19 thành phần hóa học. Trong đó, các thành phần chiếm hàm lượng cao là D – Verbenone (30,21%), cinnamyl alcohol (16,70%), trans – Caryophyllene (15,89%). Nghiên cứu chỉ ra rằng trans -Caryophyllene (chiếm tỷ 15,89%) là cao hơn so với nghiên cứu của Valer và đồng tác giả (2003) với trans -caryophyllene chỉ chiếm 9,1%.

Bên cạnh đó ở nghiên cứu của Nguyễn Thị Bích Huyền và đồng tác giả (2012), thành phần nổi bật trong tinh dầu rau tần được trồng ở huyện Thốt Nốt thành phố Cần Thơ là carvacrol (69%), cymene (9%) không có sự có mặt của d – verbenone và cinnamyl alcohol và trans – caryophyllene chỉ chiếm 4%.

• Theo Adinee và đồng tác giả (2008), những thành phần chính trong tinh dầu rau tần là tương đối khác so với kết quả nghiên cứu của công trình này. Theo đó, thành phần tinh dầu rau tần là trans – carveol 28,89%, citronellol 25,24%, gamma – 3 – cavene 5,26%.
• Trong khi đó, kết quả của Lữ Thị Mộng Thy (2016) cho thấy thành phần chính của tinh dầu rau tần là carvacrol (63,29%), caryophyllene (12,39%), anpha – caryophyllene (2,05%), caryophyllene oxide (2,12%).

Từ kết quả thu được ở công trình này so với các công trình khác cho thấy có sự khác biệt về thành phần hóa học của tinh dầu rau tần. Sự khác biệt này có thể là do sự khác nhau về phương pháp chưng cất, độ tuổi của cây, vị trí địa lý, khí hậu và điều kiện thổ nhưỡng.

Khả năng kháng oxy hóa của tinh dầu cây rau tần

Bảng 2 cho thấy phần trăm hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của tinh dầu rau tần được khảo sát ở các nồng độ khác nhau. Kết quả cho thấy, nếu tăng nồng độ từ 5 μL/mL đến 25 μL/mL thì giá trị SC% của tinh dầu tăng dần từ 45,848 % đến 62,656 %, chứng tỏ thể tích tinh dầu càng tăng thì khả năng kháng oxy hóa của tinh dầu càng cao.

Khả năng kháng oxy hóa thể hiện tốt nhất ở công thức 6 với khả năng bắt gốc tự do là 62,656 %. Khả năng kháng oxy hóa của tinh dầu rau tần tương đối cao (IC50= 9,19 μg/mL) và chỉ thấp hơn vitamin C (IC50 = 4,36 μg/mL) 2,1 lần.

• Theo nghiên cứu của Manjamalai và đồng tác giả (2012) đã công bố rằng tinh dầu rau tần thể hiện khả năng kháng oxy hóa đáng kể chống lại các tế bào ung thư phổi gây ra bởi dòng tế bào trong cả hai mô hình (in vitro và in vivo) có thể là do sự hiện diện của các hợp chất phytochemical như carvacrol và thymol.
• Alpha -Terpinene (1,72%), Gamma-Terpinene (1,02%) được công bố là có khả năng chống oxy hóa đáng kể (Brand et al., 2001). Các hợp chất này có thể ngăn chặn sự sản xuất superoxide và gốc tự do làm hư hại đến các thành phần của tế bào.

Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu cây rau tần

Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu cây rau tần được xác định dựa trên khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn, thể hiện qua đường kính vòng kháng khuẩn được tạo ra trên đĩa petri.

Kết quả bảng 3 chỉ ra rằng tinh dầu cây rau tần có khả năng kháng 2 chủng vi khuẩn E. coli và Salmonella. Mức độ kháng phụ thuộc vào nồng độ của tinh dầu sử dụng. Ngoài mẫu đối chứng không có khả năng kháng khuẩn ra thì các nồng độ còn lại đều ức chế được sự phát triển vi khuẩn.

• Ngay từ nồng độ pha loãng 0,5% đã xuất hiện vòng tròn kháng khuẩn tuy không lớn nhưng đã cho thấy được hai loại vi khuẩn đã bị ức chế ở nồng độ khảo sát nhỏ nhất. Đường kính đo được khá nhỏ với vòng kháng của E. coli đo được là 2,5 mm, với Salmonella đường kính vòng kháng đo được là 3,17 mm.
• Tuy nhiên, ở nồng độ cao hơn từ 1%, 2%, 4% thì vòng tròn kháng khuẩn đã có sự khác biệt rõ rệt. Ở nồng độ 1% đường kính vòng kháng khuẩn đối với E.coli là 6 mm với samonella là 7 mm và tăng dần ở các nồng độ 2%, 4% với đường kính vòng tròn kháng khuẩn lần lượt với E. coli là 8,5 mm, 13,5 mm và Samonella là 10 mm, 14 mm.

==> Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Hassani và đồng tác giả (2012) về khả năng kháng khuẩn của tinh dầu rau tần trên chủng gram (+) (S. aureus) và chủng gram (-) (E. coli). Điều này lý giải việc sử dụng cây rau tần như một vị thuốc trong dân gian để chữa một số bệnh như cảm lạnh, hen suyễn, ho, sốt…

KẾT LUẬN

• Nghiên cứu chỉ ra rằng hàm lượng tinh dầu của rau tần được trồng trên địa bàn Thừa Thiên Huế chiếm 1,83%. Trong đó gồm một số các hợp chất chính như D – Verbenone (30,21%), cinnamyl alcohol (16,70%), trans -Caryophyllene (15,89%).
• Thông số tối ưu của quá trình chưng cất thu tinh dầu là 2 giờ với tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 4/1. Bên cạnh đó, ở nồng độ 25 (μL/mL), tinh dầu rau tần có khả năng bắt gốc tự do là lớn nhất đạt 62,656a%.
• Tinh dầu rau tần thể hiện khả năng ức chế sự phát triển của 2 loài vi khuẩn khảo sát là E. coli, Salmonella tốt nhất ở nồng độ 100%.

Chia sẻ

Chia sẻ

Tạp chí Nghiên cứu khoa học và Phát triển kinh tế – Trường Đại học Tây Đô. 09: 249-258

Mục đích của nghiên cứu nhằm xác định hàm lượng polyphenol và flavonoid toàn phần, hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết trên cây Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.). Nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp Folin – Ciocalteu, aluminium chloride colorietric và DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl). Kết quả cho thấy cao chiết lá Ké đầu ngựa có hàm lượng polyphenol, flavonoid toàn phần cao nhất và thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa mạnh hơn so với các cao chiết thân, trong đó cao chiết lá với ethanol 50% có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh nhất (IC50 = 294,36 ± 2,99 µg/mL), nhưng vẫn thấp hơn acid ascorbic (28,71 ± 0,09 µg/mL). Hàm lượng hoạt chất và hoạt tính sinh học của các mẫu cao chiết từ thân và lá có sự biến động tùy thuộc vào dung môi chiết và điều kiện tự nhiên của vùng trồng dược liệu. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy có sự tương quan thuận giữa hàm lượng polyphenol, flavonoid và khả năng kháng oxy hóa (1/IC50) với r = 0,92.

GIỚI THIỆU

Polyphenol và flavonoid là nhóm các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên tồn tại trong thực vật, có nhiều chức năng sinh học quý đã được chứng minh qua nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới, đặc biệt là khả năng kháng oxy hóa (Milner, 1994; Duthie et al., 2000; Matan et al., 2006; Garcia-Salas et al., 2010), từ đó giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxy hóa trong cơ thể, làm giảm quá trình gây bệnh cũng như giảm tỷ lệ ung thư, ngăn ngừa các rối loạn hay thoái hóa liên quan đến não, thần kinh, viêm khớp, tim mạch… (Shiozawa et al., 2017).

Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.) là loài cây mọc hoang được sử dụng trong các bài thuốc dân gian ở Việt Nam, các nước Bắc Mỹ, Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc…

Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy Ké đầu ngựa có khả năng kháng oxy hóa, kháng khuẩn và gây độc trên tế bào ung thư với thành phần hóa học giàu hoạt tính sinh học được biết đến như là xanthanoid, dẫn xuất của acid quinic, thiazindion… (Sato et al., 1997; Kim et al., 2003; Tao et al., 2013; Fan et al., 2019) tuy nhiên, các nghiên cứu chủ yếu được thực hiện trên quả.

• Theo Sheu et al. (2003), hoạt tính kháng oxy hóa của quả Ké đầu ngựa là do các hợp chất nhóm polyphenol như acid caffeic, acid 1,3,5-tri-O-caffeoyl quinic, kali 3-O-caffeoyl quinat và acid 1,5-tri-O-caffeoyl quinic quyết định.
• Bên cạnh đó, dịch chiết nước từ quả cũng cho hiệu quả khử DPPH từ 35,2% – 79,1% trong khoảng 0,05 – 0,2 mg/mL (Huang et al., 2011). Ngoài ra, tinh dầu của quả Ké đầu ngựa cũng đã được chứng minh có năng kháng oxy hóa với IC50 = 138,87 µg/mL (Ghahari et al., 2017).

Tại Việt Nam, các chất kháng oxy hóa từ thân và lá Ké đầu ngựa chưa được nghiên cứu nhiều, đây có thể là một nguồn nguyên liệu có tiềm năng cung cấp các hoạt chất có khả năng kháng oxy hóa nhưng chưa được khai thác. Mục đích của nghiên cứu nhằm xác định hàm lượng polyphenol và flavonoid toàn phần ảnh hưởng đến hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết từ thân và lá Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.) thu ở Trà Vinh và An Giang.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu nghiên cứu

Thân và lá cây Ké đầu ngựa được thu hái tại 2 tỉnh Trà Vinh và An Giang, sau đó được rửa sạch, để ráo, phơi khô, xay nhỏ được lưu tại phòng thực hành Hóa sinh, trường đại học Tây Đô để sử dụng cho nghiên cứu.

Phương pháp nghiên cứu

Hóa chất, thiết bị

• Ethanol 50%, 96%, nước cất, DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) (Anh), methanol (Trung Quốc), acid ascorbic (Bỉ), acid gallic (Sigma), quercetin (Sigma).

Chiết xuất và thu cao ethanol toàn phần

Bột thân và lá Ké đầu ngựa của 2 vùng được để riêng, chiết xuất bằng phương pháp ngâm lạnh có hỗ trợ siêu âm với dung môi ethanol ở 2 nồng độ (50% và 96%) (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007; Novak et al., 2008).

• Rót dung môi ethanol (50% và 96%) vào bình cho đến khi xấp bề mặt dược liệu, ngâm trong 30 phút rồi tiến hành đánh siêu âm trong 30 phút.
• Sau đó, dung dịch chiết được lọc qua giấy lọc; cô đuổi dung môi sẽ có được cao chiết.
• Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chứa dược liệu và tiếp tục quá trình chiết cho đến khi nhỏ dịch chiết lên lam kính, làm khô lam, nhìn không còn thấy vết để lại (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).

Xác định hàm lượng polyphenol

Hàm lượng polyphenol toàn phần được xác định dựa theo mô tả của Singleton and Rossi (1965). Sử dụng methanol để pha loãng 8 mẫu cao chiết (TV50, TV96, LV50, LV96, TA50, TA96, LA50, LA96) để đạt nồng độ 0,5 mg/mL và dung dịch chuẩn acid gallic có nồng độ 0, 10, 20, 30, 40, 50 μg/mL.

Xác định hàm lượng flavonoid

Hàm lượng flavonoid được xác định dựa trên mô tả của Marinova et al.(2005). Sử dụngmethanol để pha loãng 8 mẫu cao chiết để đạt nồng độ 1 μg/mL và dung dịch chuẩn quercetin có nồng độ 0, 10, 20, 40, 60, 80 µg/mL.

Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa

Khả năng kháng oxy hóa được thực hiện theo phương pháp DPPH (Blois, 1958; Chanda and Dave, 2009). Sử dụng methanol để pha loãng các mẫu cao chiết để đạt nồng độ phù hợp và dung dịch acid ascorbic nồng độ 10, 20, 30, 40, 50 µg/mL.

Xử lý số liệu

Trong nghiên cứu, mỗi thí nghiệm tiến hành lặp lại 3 lần, kết quả trình bày ở dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Kết quả được tính toán bằng phần mềm Microft Office Excel. Số liệu được xử lý tương quan bằng phần mềm SPSS. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% khi P < 0,05.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Hàm lượng polyphenol và flavonoid trong các loại cao chiết

Hàm lượng polyphenol toàn phần (TPC) và flavonoid toàn phần (TFC) trong các mẫu cao thử nghiệm có sự khác biệt giữa 2 vùng khảo sát, kết quả thể hiện qua Bảng 1.

Nhận xét:

Nhìn chung, các cao chiết từ lá hàm lượng polyphenol và flavonoid toàn phần cao hơn các mẫu chiết từ thân. Hàm lượng polyphenol toàn phần của 8 mẫu cao chiết dao động từ 8,58 – 68,14 mg GAE/g dược liệu khô.

Trong đó, mẫu cao chiết LA96 có hàm lượng polyphenol cao nhất và mẫu TV96 có hàm lượng thấp nhất. Hàm lượng flavonoid toàn phần của 8 mẫu cao chiết dao động từ 3,86 – 62,95 mg QE/g dược liệu khô, cao nhất là mẫu LV50 Theo Lu and Foo (1995), ở thực vật, quá trình quang hợp ở lá tạo ra nhiều gốc tự do, do đó, lá cây cần có sự hiện diện nhiều các nhóm hợp chất chống lại các gốc tự do đó.

==> Các mẫu cao chiết từ thân và lá thu tại Trà Vinh với dung môi ethanol 50% cho hàm lượng polyphenol và flavonoid cao hơn dung môi ethanol 96%, nhưng các mẫu cao chiết tại An Giang thì dung môi ethanol 96% cho hàm lượng cao hơn ở mẫu lá, trong khi mẫu thân cây thì dung môi 50% cho kết quả cao hơn.

==> Sự khác biệt này có thể là do điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng dẫn đến sự khác nhau giữa hàm lượng các hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây (Mustafa et al., 2010).

Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa

Hoạt tính kháng oxy hóa của các cao thử nghiệm và acid ascorbic được thể hiện qua khả năng ức chế 50% DPPH (IC50), giá trị IC50 càng thấp thì khả năng kháng oxy hóa càng cao và ngược lại

Nhận xét:

Kết quả khảo sát cho thấy, các cao thử nghiệm đều thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa, tuy nhiên đều thấp hơn đối chứng dương acid ascorbic. Ở chỉ tiêu này, các cao chiết từ lá cũng thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa mạnh hơn so với các cao chiết từ thân, đặc biệt là LV50 (IC50 = 294,36 ± 2,99 µg/mL), điều này cũng phù hợp với kết quả về hàm lượng polyphenol và flavonoid toàn phần có trong các mẫu nghiên cứu (Bảng 1).

Theo Garcia-Salas et al. (2010), khi đề cập đến các chất có khả năng kháng oxy hóa có trong các loài thực vật, mối quan tâm đầu tiên chính là hàm lượng các hợp chất polyphenol và flavonoid.

• Kết quả (Bảng 2) cũng cho thấy, có sự khác biệt về khả năng kháng oxy hóa của các cao chiết lá tại 2 vùng, cụ thể là tại Trà Vinh thì khả năng kháng oxy hóa của LV50 (IC50 = 294,36 ± 2,99 µg/mL) cao hơn so với LV96 (IC50 = 538,52 ± 12,52 µg/mL), tại An Giang thì cho kết quả ngược lại khả năng kháng oxy hóa của LA96 (IC50 = 404,59 ± 2,06 µg/mL) cao hơn LA50 (IC50 = 963,76 ± 12,16 µg/mL).

Phân tích sự tương quan giữa các đại lượng khảo sát trên các mẫu cao chiết bằng phép so sánh Pearson (Bảng 3) cho thấy, hàm lượng polyphenol và flavonoid trong các mẫu cao thử nghiệm có sự tương quan rất cao (r = 0,94), với P < 0,01.

Nhận xét:

Hàm lượng polyphenol và flavonoid có tương quan thuận với giá trị 1/IC50 với hệ số tương quan lần lượt là r = 0,73 và r = 0,87, tương ứng với hàm lượng polyphenol và flavonoid có trong cao chiết càng cao thì khả năng kháng oxy hóa càng mạnh.

Điều này phù hợp với nhận định của Lu and Foo (1995), polyphenol là nhóm hợp chất có khả năng kháng oxy hóa nổi bật nhất của thực vật, trong đó flavonoid được coi là chất kháng oxy hóa mạnh, hơn vitamin C, vitamin E và carotenoid (Rice-Evans et al.,1996).

• Kết quả này cũng tương tự với nghiên cứu của Scherer and Godoy (2014) trong chiết xuất lá Ké đầu ngựa, tổng hàm lượng polyphenol và khả năng kháng oxy hóa có sự tương quan thuận cao với r = 0,97.

KẾT LUẬN

• Có sự tương quan giữa hàm lượng polyphenol, flavonoid và khả năng kháng oxy hóa của các cao chiết từ bộ phận thân, lá của cây Ké đầu ngựa thu tại An Giang và Trà Vinh.
• Cao chiết lá có hàm lượng hai hoạt chất này cao hơn thân. Hàm lượng hoạt chất có biến động theo điều kiện tự nhiên của vùng sinh thái trồng dược liệu. Mặt khác, dung môi chiết xuất ethanol 96% có khuynh hướng đạt hiệu quả tốt hơn so với 50%.
• Hoạt tính kháng oxy hóa thấp hơn đối chứng dương acid ascorbic, và khá biến động giữa thân, lá, vùng trồng và dung môi chiết. Cao chiết từ lá thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa mạnh hơn so với các cao chiết từ thân. Hàm lượng polyphenol và flavonoid có tương quan thuận với giá trị 1/IC50 với r = 0,92.

Chia sẻ

Chia sẻ

Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ, 1(6), tr 49-57

Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum Thunb. Makino) là thảo dược được dân gian sử dụng nhiều trong việc chữa trị các bệnh như đái tháo đường, lipid máu cao, hỗ trợ điều trị tim mạch, ung thư [1]…Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá một số hoạt tính sinh học của cây Giảo cổ lam như khả năng kháng oxy hóa, kháng khuẩn, ức chế enzyme α-glucosidase và enzyme lipase. Qua đó đã chứng minh được tiềm năng có thể làm nguồn dược liệu có giá trị của cao chiết ethanol cây Giảo cổ lam trong việc điều trị một số bệnh phổ biến hiện nay.

MỞ ĐẦU

Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum Thunb. Makino) là cây thuốc dân gian của Trung Quốc và Nhật Bản, thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae), là loài dây leo lâu năm, lá kép gồm 5 lá chét mọc xen kẽ. Cây được tìm thấy nhiều ở Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc; ở Việt Nam, cây được tìm thấy ở Lào Cai (Sapa), Hà Giang, Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh (Móng Cái), Hoà Bình, Thừa Thiên – Huế, Kontum, Gia Lai [2].

Hình ảnh cây Giảo cổ lam

Từ xưa, Giảo cổ lam được sử dụng để bồi bổ sức khoẻ, chống lão hóa, trị đái tháo đường [3], và còn có tên là cây cỏ thần kỳ hoặc nhân sâm cho người nghèo vì thành phần có hoạt tính chủ yếu trong cây là các saponin triterpen gọi là gypenoside. Các hoạt tính sinh học chủ yếu của Giảo cổ lam được chứng minh trên thế giới bao gồm kháng oxy hóa, kháng khuẩn, giảm lượng đường huyết, giảm huyết khối, giảm mỡ máu, chống béo phì, kháng ung thư, chống tăng huyết áp, cải thiện hệ miễn dịch, duy trì sức khoẻ tim mạch [3]…

Thành phần hóa học chủ yếu của Giảo cổ lam được công bố ngoài gypenoside còn có các hợp chất tự nhiên như flavonoid, steroid, polysaccharide, phenol,…. Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam chưa có công bố về đánh giá hoạt tính sinh học phổ biến của loài cây này cũng như hoạt tính của cao chiết ethanol so với cao nước.

Vì thế nghiên cứu này được thực hiện nhằm:

==> Đánh giá các hoạt tính sinh học nổi bật của cây Giảo cổ lam như hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa, ức chế enzyme α-glucosidase, lipase đối với các cây được trồng tại Việt Nam nhằm chứng minh giá trị dược liệu của loài cây thuốc dân gian này.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

• Cây Giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum thu hái từ Đà Lạt, Lâm Đồng.
• Các chủng vi khuẩn Các chủng vi khuẩn gây bệnh như Streptococcussp., Salmonella typhi, Acetobacteriumsp., Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli

Các chủng vi sinh vật được cung cấp bởi Phòng Thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.

Điều chế cao chiết

Điều chế cao nước: Cao chiết nước được thực hiện theo phương pháp sắc thuốc truyền thống.

Phơi khô, xay nhỏ toàn bộ cây, cân đúng 250 g bột cây, bổ sung 500 mL nước, gia nhiệt ở 40 º C trong 4 giờ, khuấy đều, lọc lấy phần nước, lặp lại nhiều lần, sau đó phần dịch nước được đông khô chân không thu được cao nước.

Điều chế cao ethanol: Phương pháp điều chế cao được thực hiện theo kỹ thuật chiết ngâm dầm (maceration) [4].

• Toàn cây Giảo cổ lam ngoài tự nhiên đượcrửa sạch bằng nước, phơi khô đến khối lượng không đổi, rồi xay nhuyễn thành bột khô.
• Ngâm bột cây trong ethanol tuyệt đối.
• Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày.
• Sau đó, dung dịch được chiết lọc qua giấy lọc, thu dịch lọc.
• Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình bột mẫu và tiếp tục quá trình chiết thêm vài lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu.
• Phần dịch lọc được cô quay chân không đuổi dung môi ở 40º C để có được cao chiết.

Định tính một số nhóm chức có trong cao chiết:

Cao chiết nước và ethanol của Giảo cổ lam bằng các phản ứng định tính hóa học đặc trưng [4]. Mẫu thử nghiệm được pha trong ethanol tuyệt đối hoặc nước cất (tuỳ loại cao) với nồng độ 1 mg/mL.

• Định tính phenol bằng FeCl3
• Định tính tanin
• Định tính alkaloid
• Định tính flavonoid
• Tác dụng với dung dịch 1 % NaOH/ethanol
• Tác dụng với dung dịch 1 % AlCl3/ethanol
• Phản ứng Cyanidin của Wilstatter
• Định tính terpenoid- steroid Phản ứng Rosenheim để phát hiện steroid – triterpenoid
• Phản ứng Salkowski để phát hiện steroid
• Định tính saponin
• Định tính glycosid

Hoạt tính kháng khuẩn:

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết đã điều chế từ hai dung môi nước và ethanol bằng phương pháp đo đường kính vòng vô khuẩn [5]:

• Nuôi cấy dịch huyền phù vi khuẩn thử nghiệm trong môi trường Luria – Bertani (LB) lỏng lắc ở 37 ºC
• Điều chỉnh dịch huyền phù vi khuẩn đạt độ đục chuẩn BaSO4 0,5 McFarland (OD 625 nm)
• Trải 100μL dịch khuẩn đã chuẩn độ đục lên đĩa petri chứa môi trường thạch LB, tiến hành đục lỗ thạch với đường kính 7 mm; nạp 50 μL cao chiết hòa tan trong DMSO 100 % vào lỗ thạch (nồng độ 10 mg/mL)
• Ủ trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng, sau đó đo đường kính vòng kháng khuẩn, chứng âm DMSO 100 %.

Hoạt tính kháng khuẩn của hợp chất càng mạnh, đường kính vòng kháng khuẩn xung quanh lỗ thạch càng lớn. Lặp lại 3 lần cho mỗi nghiệm thức.

Hoạt tính kháng oxy hóa:

Khảo sát khả năng khử của cao chiết ethanol và nước của cây Giảo cổ lam bằng phương pháp thử năng lực khử của Yen và Duh (1993) [6]

• Hút 1 mL dịch chiết chất thử nghiệm; 2,5 mL dung dịch đệm sodium phosphate 0,2 M pH 6,6; 2,5 mL dung dịch potassium ferricyanide 1 %
• Ổn định ở 50 o C trong 20 phút; thêm 2,5 mL trichloroacetic acid 10 %; ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút; thu dịch nổi
• Hút 1 mL dịch nổi qua ống nghiệm khác; thêm 2 mL nước cất và 0,5 mL dung dịch FeCl3 1 %; lắc đều rồi để yên sau 5 phút; đo ở bước sóng 700 nm.

Giá trị hấp thu càng cao thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa càng mạnh. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.

Khảo sát khả năng đánh bắt gốc tự do bằng phương pháp DPPH [7]:

• Hoà tan cao vào dung môi với nồng độ 2–4 mg/mL, sau đó pha loãng với các đồng độ khác nhau.
• Hút 0,3 mL dung dịch cao ở mỗi nồng độ và 1,8 mL ethanol tuyệt đối vào ống nghiệm.
• Thêm 0,3 mL dung dịch DPPH 0,6 mM (hoà tan trong ethanol tuyệt đối), lắc đều, ủ trong tối, sau 30 phút, đo giá trị hấp thu ở bước sóng 517 nm.
• Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.

Khả năng kháng oxy hóa càng cao thì sự hấp thu quang phổ ở bước sóng 517 nm càng thấp và ngược lại.

Phần trăm ức chế được tính theo công thức: I%= (ODđc- ODmẫu)/ODđc*100

Với ODđc, OD mẫu lần lượt là độ hấp thu của đối chứng và mẫu thử nghiệm.

Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase:

Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của cao chiết Giảo cổ lam được xác định theo phương pháp của Kwon, Apostolidis và Shetty (2008) [8].

• Hoà tan cao trong đệm phosphate 0,2 M chứa 5 % DMSO (chứng dương acarbose 2 mg/L), pha loãng cao thành các nồng độ khác nhau.
• Nhập 50 µL mẫu đã pha loãng vào đĩa 96 giếng, bổ sung 40 µL enzyme α-glucosidase 0,2 u/ml, ủ ở nhiệt độ phòng trong 25 phút.
• Thêm 40 µL cơ chất p-NPG 5mM, tiếp tục ủ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút, sau đó, bổ sung 130 µL Na2CO3 để dừng phản ứng.
• Đo độ hấp thu (OD) ở bước sóng 405 nm.
• Lặp lại 3 lần ở mỗi nghiệm thức.

Phần trăm ức chế của cao chiết được tính theo công thức: I%= (ODđc- ODmẫu)/ODđc*100

Với ODđc, ODmẫu lần lượt là độ hấp thu của đối chứng và mẫu thử nghiệm.

Hoạt tính ức chế enzyme lipase [9]:

• Hoà tan cao với nồng độ 8 mg/mL trong đệm phosphate 0,05 M pH 7,2 chứa 0,1 % Tween 80 và 5% DMSO (chứng dương Orlistat 12 mg/mL).
• Pha loãng mẫu ở các nồng độ giảm dần, hút mỗi nồng độ 20 µL cho vào đĩa 96 giếng đã có sẵn 140 µL đệm và 20 µL enzyme lipase 1 mg/mL, ủ ở nhiệt độ phòng trong 60 phút.
• Thêm 20 µL cơ chất pNPB 5 mM, lắc nhẹ, sau 5 phút đo độ hấp thu (OD) với bước sóng 405 nm.
• Mỗi nghiệm thức được thực hiện 3 lần.

Phần trăm ức chế của cao chiết được tính theo công thức: I%= (ODđc- ODmẫu)/ODđc*100

Với ODđc, ODmẫu lần lượt là độ hấp thu của đối chứng và mẫu thử nghiệm.

Phân tích và xử lý số liệu Các phép toán thống kê được thực hiện bằng phần mềm Microsoft Excel 2013 và SPSS 22.0

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Định tính một số nhóm chức có trong cao chiết

Kết quả định tính cho thấy Giảo cổ lam có chứa nhiều nhóm hợp chất như phenol, alkaloid, flavonoid (flavonol, auron, isoflavol, flavanol, chalcone…), terpenoid, steroid, saponin (Bảng 1).

Kết quả cho thấy:

Cao ethanol cây Giảo cổ lam có nhiều hợp chất hơn cao nước, đáng chú ý là các hợp chất flavonoid và saponin, cao ethanol có cả hai loại saponin triterpenoid và steroid trong khi cao nước chỉ chứa saponin steroid. Chính vì có sự hiện diện của nhiều nhóm hợp chất tự nhiên nên cây Giảo cổ lam có nhiều hoạt tính sinh học có giá trị dược liệu.

• Hơn nữa, theo Zhuohong Xie và cs. (2010) khi nghiên cứu thành phần hóa học của 5 loại Giảo cổ lam thương mại cho thấy trong thành phần Giảo cổ lam có chứa flavonoid cụ thể là rutin và quercetin với hàm lượng cao [10].
• Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng chứng minh Giảo cổ lam có nhiều loại saponin khác nhau có cấu trúc và hoạt tính tương tự như saponin của Panax gingseng [11], cùng với kết quả nghiên cứu này có thể thấy, khi dùng Giảo cổ lam hòa tan trong ethanol (ngâm rượu trong dân gian) hiệu quả hơn so với việc sắc thuốc nước.

Hoạt tính kháng khuẩn

Mỗi lỗ thạch chứa 0,5 mg cao chiết với nồng độ 10 mg/mL hoà tan trong DMSO 100% với chứng dương là kanamycine và chứng âm là DMSO 100 %. Kết quả đo đường kính vòng kháng khuẩn được thể hiện trong Bảng 2.

Kết quả cho thấy:

Cao chiết Giảo cổ lam có khả năng ức chế sinh trưởng các chủng vi khuẩn gây bệnh nhưng không mạnh (đường kính vòng kháng khuẩn <10 mm).

Trong đó, cao ethanol có khả năng ức chế sinh trưởng trên tất cả các chủng vi khuẩn dùng trong thử nghiệm và thể hiện mạnh nhất đối với chủng Pseudomonas (đường kính vòng vô khuẩn là 6,67 mm) và yếu nhất đối với chủng Streptococcus (đường kính vòng vô khuẩn 4,33 mm), tuy nhiên cao nước chỉ có khả năng ức chế sinh trưởng hai chủng là Salmonella và Staphylococcus.

• Nhìn chung, khả năng ức chế sinh trưởng của cao chiết ethanol Giảo cổ lam đối với các chủng Gram âm và Gram dương là tương đương nhau.
• Thêm vào đó, theo Danuree và cs. (2011) [12] khi khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết ethanol và nước với các chủng S. typhi, E. coli, S. aureus cho thấy cao chiết ethanol và nước của Giảo cổ lam có thể ức chế sinh trưởng 3 chủng này với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là 15,62 mg/mL.

Hoạt tính kháng oxy hóa

Khảo sát khả năng khử của cao chiết ethanol và nước của cây Giảo cổ lam. Năng lực khử của cao chiết Giảo cổ lam được thể hiện trong Hình 1 và Bảng 3, 4.

Kết quả cho thấy:

Năng lực khử của một chất là khả năng chất đó cho điện tử khi tham gia phản ứng oxy hóa khử, vì thế, năng lực khử cũng thể hiện khả năng kháng oxy hóa của chất đó. Lực khử được xác định dựa trên sự đổi màu của dung dịch cao chiết khi xảy ra phản ứng với FeCl3 tạo phức chất ferric ferrocyanide có màu xanh, hấp thu cực đại ở bước sóng 700 nm.

Kết quả cho thấy, cao ethanol có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh hơn cao nước, năng lực khử cao hơn gấp 2 lần (0,810 so với 0,396) ở nồng độ 4 mg/mL.

Kết quả kháng oxy hóa bằng phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH của cao ethanol và nước cây Giảo cổ lam và IC50 của từng loại cao được thể hiện trong Hình 1.

Cao ethanol có khả năng bắt gốc tự do DPPH cao hơn cao nước rõ rệt, phần trăm ức chế của cao ethanol cao hơn cao nước gấp 4 lần. Hơn nữa, kết quả định tính trong nghiên cứu này cho thấy cao chiết ethanol có chứa thành phần flavonoidmà theo nhưW. Zhaojing (2007) và E. Kelly (2002) đã công bố là có khả
năng kháng oxy hóa tốt [13, 14].

Hoạt tính ức chế α-glucosidase

Enzyme α-glucosidase thủy phân polysaccharide sau khi thủy giải thành các đường đơn, dễ hấp thu hơn, do đó để chữa bệnh đái tháo đường type 2 cần giảm lượng đường hấp thu vào máu bằng cách ức chế enzyme này, kết quả được thể hiện trong Hình 2 và Bảng 4.

Kết quả cho thấy:

• Cao chiết ethanol có hoạt tính ức chế enzyme α- glucosidase cao hơn nhiều so với cao nước.
• Ở nồng độ 4 mg/mL, phần trăm ức chế của cao ethanol và nước lần lượt là 87,435 % và 54,251 %, cao hơn so với phần trăm ức chế cao nhất của chứng dương ở 20 mg/mL (82,231 %).
• Tương tự, nồng độ ức chế 50 % (IC50) của hai cao lần lượt là 0,181mg/mL và 3,672 mg/mL, cao hơn so với acarbose là 0,411 mg/mL. Có thể thấy rằng cao ethanol do có chứa nhiều thành phần các hợp chất tự nhiên có hoạt tính hơn nên có hoạt tính cao hơn, ức chế enzyme α-glucosidase tốt hơn so với cao nước.

Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của nhóm Huyen và cs. (2012) Đại học Dược Hà Nội về khả năng hỗ trợ chữa bệnh đái tháo đường và cải thiện lượng đường huyết của Giảo cổ lam khi thí nghiệm lâm sàng [15, 16].

Hoạt tính ức chế lipase

Lipase là enzyme đường ruột xúc tác thủy phân lipid thành acid béo tự do để cơ thể hấp thu [8], vì thế để chữa bệnh béo phì cần ức chế enzyme này.

Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế enzyme lipase của cao chiết Giảo cổ lam được thể hiện trong Bảng 2 và Hình 4. Kết quả cho thấy cao ethanol có hoạt tính ức chế enzyme lipase cao nhất là 73,876 % cao hơn cao nước có phần trăm ức chế là 70,927 %. IC50 tương ứng của hai cao là 2,968 mg/mL và 4,483 mg/mL.

Kết quả trên cùng với kết quả định tính các thành nhóm chức cho thấy khả năng ức chế enzyme lipase của cao ethanol vượt trội hơn so với cao nước, liên quan đến sự hiện diện các hợp chất có hoạt tính sinh học cao như phenolic, flavonoid, saponin như công bố củaCristian R. (2006) chứng minh các hợp chất trên đều có khả năng ức chế enzyme lipase [17].

KẾT LUẬN

• Cao chiết cây Giảo cổ lam có các hoạt tính sinh học như kháng oxy hóa, kháng khuẩn, ức chế enzyme α-glucosidase, trong đó, cao ethanol có các hoạt tính cao hơn hẳn cao nước ở tất cả các hoạt tính trong nghiên cứu này như kháng oxy hóa, kháng khuẩn, ức chế enzyme α-glucosidase và lipase.
• Các thành phần hóa học được nhận diện trong cao ethanol đã khẳng định thêm về hoạt tính của cao chiết này. So với cao nước, cao ethanol chứa nhiều thành phần flavonoid và saponin hơn, đây cũng chính là những hợp chất có hoạt tính sinh học chính trong cây. Hơn nữa, cao ethanol cũng cho thấy khả năng ức chế enzyme α-glucosidase vượt trội hơn các hoạt tính khác, điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng của Giảo cổ lam đối với lĩnh vực hỗ trợ chữa trị đái tháo đường type 2 là rất lớn.
• Kết quả này góp phần chứng minh giá trị dược liệu của Giảo cổ lam bên cạnh những ứng dụng đã được dân gian sử dụng.

Nguồn: Tống Tiểu Hoa, Vũ Thị Bạch Phượng, Dương Công Kiên, Quách Ngô Diễm Phương (2017), Khảo sát hoạt tính sinh học cây Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum Thunb. Makino), Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ, 1(6), tr 49-57.

Chia sẻ

Chia sẻ