GIỚI THIỆU

Celastrus hindsii là một loài thực vật thuộc họ Celastraceae. Ở Việt Nam, C. hindsii mọc tự nhiên trong rừng và phổ biến là tìm thấy ở một số tỉnh như Hà Nam, Hòa Bình, Quảng Ninh và Ninh Bình.

Hình ảnh cây Xạ đen ngoài tự nhiên

Xạ đen được sử dụng điều trị chứng viêm, và chống ung thư và kháng u thuộc tính [2]. Các nhà khoa học đã phát hiện và phân lập chất maytenfolone A và celasdine B của C. hindsii có khả năng gây độc tế bào mạnh đối với các dòng tế bào ung thư, cũng như chống lại sự sao chép của HIV hoạt động [4].

Các hợp chất phenolic có nhiều dược lý các hoạt động, chẳng hạn như khả năng chống oxy hóa và chống viêm, và cho thấy sự ức chế mạnh mẽ chống lại bệnh tim mạch, ung thư và tiểu đường. Bên cạnh đó, chất chống oxy hóa đã được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp và y học. Khả năng phản ứng của họ có thể giúp ngăn ngừa lão hóa, kháng khuẩn, kháng viêm, hủy hoại tế bào và chống ung thư [9].

Nghiên cứu này được thực hiện để đánh giá hoạt động chống oxy hóa, tổng hàm lượng phenolic (TPC), và tổng hàm lượng flavonoid (TFC) của C. hindsii. Việc xác định các thành phần hoạt động đã được tiến hành để xác định các hợp chất chịu trách nhiệm về tiềm năng chống oxy hóa của cây này bằng cách sử dụng phương pháp sắc kí (GC-MS) và (EIS-MS) để phân tích.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Nguyên liệu thực vật

• Lá cây C. hindsii được thu hái ở xã Cao Dương, huyện Lương Sơn, tỉnh Hòa Bình, Việt Nam.
• Mẫu được làm khô trong tủ sấy ở 30 ◦C trong một tuần, và sau đó nghiền thành bột thành bột mịn.

Chuẩn bị chiết xuất

• Ngâm 1,12 kg bột C. hindsii trong metanol trong 30 ngày ở điều kiện môi trường xung quanh.
• Sau đó, chiết xuất metanol thô được tách bằng hexan, etyl axetat, và dung dịch nước để thu được lần lượt các dịch chiết 33,32 g, 133,33 g và 55,30 g.
• Chiết xuất EtOAc, được phân đoạn bằng sắc ký cột sử dụng kỹ thuật gradient rửa giải (cloroform và metanol) để thu được 14 phân đoạn (Bảng 1).
• Quá trình chưng cất phân đoạn của chiết xuất EtOAc.

Xác định tổng hàm lượng phenolic

• Hàm lượng phenol được đánh giá bằng phương pháp Folin-Cicalteau [13].
• Các mẫu thử nghiệm được trộn với 0,125 mL thuốc thử Folin-Ciocalteu và sau đó lắc trong 6 phút. Sau đó, thêm 1,25 mL Na2CO3 7% vào.
• Các dung dịch hỗn hợp được điều chỉnh bằng methanol đến thể tích 3 mL, trộn kỹ và ủ ở nhiệt độ môi trường trong điều kiện tối.
• Độ hấp thụ sau đó được ghi lại ở bước sóng 765 nm.
• Tổng hàm lượng phenol được biểu thị bằng miligam đương lượng axit gallic trên gam dịch chiết hoặc phần (mg GAE / g dịch chiết) theo đường cong chuẩn.
• Tất cả các mẫu được phân tích trong 3 lần lặp lại.

Xác định tổng hàm lượng flavonoid

• Tổng hàm lượng flavonoid của C. hindsii được xác định bằng phương pháp màu nhôm clorua [14].
• Cho 100 µL nhôm (III) clorua hexahydrat (2%) vào 100 µL mẫu chuẩn rutin.
• Sau khi ủ ở nhiệt độ phòng và trong điều kiện tối trong 15 phút, độ hấp thụ được đo ở bước sóng 430 nm.
• Tổng hàm lượng flavonoid là được tính theo đường cong chuẩn và được biểu thị bằng mg rutin đương lượng trên mỗi g dịch chiết hoặc phần (mg RE / g chiết xuất)

Tính chất chống oxy hóa

Phương pháp 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)

• Hoạt tính chống oxy hóa của chiết xuất và các phân đoạn cô lập được ước tính bởi phương pháp DPPH [15].
• Trộn hỗn hợp chứa 0,5 mL mỗi mẫu, 0,25 mL 0,5 nM DPPH, và 0,5 mL dung dịch đệm axetat 0,1 M (pH 5,5) được chuẩn bị và đặt trong bóng tối trong 30 phút ở điều kiện môi trường xung quanh.
• Độ hấp thụ của phản ứng được ghi lại ở bước sóng 517 nm bằng cách sử dụng đầu đọc vi tấm (Máy quang phổ MultiskanTM Microplate, Thermo Fisher Scientific, Osaka, Nhật Bản).
• Khả năng chống oxy hóa của các mẫu thử nghiệm được tính theo công thức sau:
• Hoạt động chống gốc tự do DPPH (%) = [(C – S) / C] × 100 (trong đó S và C là độ hấp thụ tương ứng của phản ứng có mẫu và phản ứng không có mẫu.)
• Kết quả là được biểu thị bằng giá trị IC50, xác định nồng độ của mẫu cần thiết để quét 50% của DPPH.

 Phương pháp 2,20-Azinobis (3-Ethylbenzothiazoline -6-sulfonic acid) (ABTS)

Phương pháp ABTS được sử dụng để đánh giá đặc tính chống oxy hóa của C. hindsii [16].

Thử nghiệm tẩy trắng β-Caroten

Phương pháp tẩy trắng β-caroten được sử dụng để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của C. hindsii [17].

Xác định các thành phần hóa học bằng phương pháp sắc ký khí-khối phổ (GC-MS)

• Các thành phần hóa học của các phân đoạn hoạt động được xác định bằng cách sử dụng hệ thống GC-MS (JMS-T100 GVC, JEOL Ltd., Tokyo, Japan), theo các phương pháp trước đây [18,19].
• Phân tích được tiến hành trong cột DB-5MS (30 m × 0,25 mm, dày 0,25 µm) sử dụng heli làm khí mang, được thực hiện với tỷ lệ phân chia 5: 1.
• Nhiệt độ kim phun và đầu dò được duy trì ở 300 ◦C và 320 ◦C.
• Nhiệt độ lò được thiết lập như sau: nhiệt độ bạn đầu 50 ◦C , tăng 10 ◦C / phút đến 300 ◦C, với thời gian giữ 20 phút.
• Các mẫu được pha loãng trong MeOH, và thể tích tiêm của mỗi mẫu là 1 µL.
• Phạm vi khối lượng quét từ 29 amu đến 800 amu.

Phân tích khối phổ-ion hóa tia điện tử (ESI-MS)

• Các mẫu được phân tích bằng ESI-MS ở cả chế độ ion âm và dương.
• Mao mạch nhiệt độ được đặt ở 140 ◦C (120 ◦C đối với S2) và điện áp phun là 3.0 KV (2.7 Kv đối với S2).
• Bên trong chế độ tích cực, các phân tích hợp chất được thực hiện trong điện áp phun ion 3000 V và mao quản nhiệt độ 350 ◦C.
• Các đỉnh được quét từ 280 đến 1000 m / z [20].

Phân tích thống kê

Phân tích thống kê được thực hiện bằng cách sử dụng ANOVA một chiều, sự khác biệt đáng kể (p <0,05) trong số các mẫu thử nghiệm. Kết quả được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± sai số tiêu chuẩn.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Hoạt động chống oxy hóa, Tổng hàm lượng Phenolic (TPC) và Tổng hàm lượng Flavonoid (TFC) của C. hindsii

• Dịch chiết EtOAC thu được lượng TPC và TFC tối đa lần lượt là 371,19 và 124,011 mg GE / g chiết xuất. Kết quả cho thấy TPC, TFC và hoạt tính chống oxy hóa của các chất chiết xuất được thử nghiệm đa dạng. Trong số các chất chiết xuất, EtOAc có TPC cao nhất (371,19 mg GAE / g chiết xuất) và TFC (124,77 mg RE / g trích).
• Tương tự, hoạt động chống oxy hóa của chiết xuất này cũng mạnh nhất (IC50 DPPH và ABTS tương ứng là 53,38 và 91,08 µg / mL) so với các chất chiết xuất khác, trong khi hexan chiết xuất không cho thấy bất kỳ hoạt động chống oxy hóa. Do hoạt động chống oxy hóa mạnh nhất của nó, EtOAc dịch chiết sau đó được tách bằng sắc ký cột bằng kỹ thuật rửa giải gradient.

Bảng 2. Hoạt động chống oxy hóa, tổng hàm lượng phenolic và tổng hàm lượng flavonoid của các chất chiết

Tổng số Phenolic (TPC) và Tổng hàm lượng Flavonoid (TFC), và Hoạt động chống oxy hóa của các phần được phân tách từ EtOAc

Nói chung, ngoại trừ P14, các phân số từ P9 – P13 cho thấy TPC và TFC lớn hơn đáng kể so với phân số P1-P8. Trong số này, TPC và TPC tối đa là quan sát thấy trên các phân đoạn P12-P12, trong đó độ pha loãng giữa cloroform và metanol nằm trong khoảng từ 50–70%. Khi tỷ lệ metanol <30% và> 90%, TPC và TFC đều giảm. Khả năng chống oxy hóa của các phần tỷ lệ tương ứng với lượng TPC và TFC.

Bảng 3. Hàm lượng TPC, TFC và hoạt động chống oxy hóa của mười bốn phần được tách ra từ Chiết etOAc bằng sắc ký cột.

Kết quả chỉ ra rằng, độ pha loãng giữa cloroform và metanol mạnh ảnh hưởng đến tiềm năng chống oxy hóa của C. hindsii, được phản ánh bởi cả hoạt động chống oxy hóa của ABTS và DPPH qua các giá trị IC50.

Trong số các mẫu này, IC50 thấp hơn cho thấy chất chống oxy hóa mạnh hơn Hoạt động. Các phân đoạn P1 – P4, P6 và P8 không cho thấy bất kỳ hoạt động chống oxy hóa nào và khi pha loãng metanol là 5%, chỉ quan sát thấy khả năng chống oxy hóa không đáng kể. Tuy nhiên, khi pha loãng metanol tăng lên> 10%, các hoạt động thu gom gốc ABTS và DPPH được tăng lên nhanh chóng.

Điện thế ABTS và DPPH tối đa được tìm thấy trong các phân đoạn P12 – P13, trong đó phần trăm methanol đã được tăng lên 50-70%. Tuy nhiên, khi độ pha loãng metanol vượt quá 70%, khả năng chống oxy hóa ngược lại đã giảm (Bảng 3). So sánh với BHT tiêu chuẩn, các phân số P12 – P13 có tiềm năng nhất, có thể chứa các thành phần hoạt động trong hoạt động chống oxy hóa, trong đó chất chống oxy hóa mức độ của các hợp chất riêng lẻ cần phân tích thêm.

Kết quả của thử nghiệm này cho thấy sự pha loãng metanol ở 50–70% kết hợp với cloroform cung cấp tiềm năng chống oxy hóa tối đa trong cả hoạt động thu dọn gốc ABTS và DPPH của cây thuốc C. hindsii. Ngược lại, khi metanol chiếm 90% dung dịch, cả hoạt động loại bỏ gốc DPPH và ABTS đều giảm nhanh chóng (Bảng 3).

Khả năng chống oxy hóa của C. hindsii cũng được đo bằng β-caroten phương pháp tẩy trắng, như trong Bảng 3. Hoạt tính chống oxy hóa được biểu thị bằng giá trị% LPI so với quá trình oxy hóa β-caroten. Hầu hết các phân đoạn từ dịch chiết etyl axetat đều có hoạt tính chống oxy hóa.

Giá trị LPI phần trăm của các phân đoạn EtOAc nằm trong khoảng từ 57% đến 90% (Bảng 3). Nó đã được quan sát rằng tất cả các dịch chiết được điều chế từ C. hindsii đều làm giảm quá trình oxy hóa của β-caroten, mặc dù mức độ sự ức chế khác nhau giữa các phân đoạn.

Trong số các phần cô lập, quá trình oxy hóa axit linoleic có hiệu quả bị ức chế bởi phân đoạn P12 (C: M = 1: 1; LPI = 90%), tiếp theo là phân đoạn P13 (98%) và P9 (87%). Những Các phân đoạn thể hiện mức độ chống oxy hóa gần với mức BHT tiêu chuẩn (Bảng 3). Kết quả này cho thấy C. hindsii có khả năng chống oxy hóa mạnh.

Mối tương quan giữa hàm lượng phenolic và các hoạt động chống oxy hóa

Các mối quan hệ của hoạt động chống oxy hóa được chỉ ra bởi xét nghiệm DPPH hoặc ABTS với tổng số phenol của C. hindsii lần lượt được trình bày trong Hình 2 và Hình 3.

Hình 2. Mối quan hệ giữa hoạt động chống oxy hóa và tổng số phenol

Kết quả cho thấy tổng số phenol tỷ lệ với hoạt động thu dọn gốc DPPH (r2 = 0,80) hoặc quét gốc ABTS (r2 = 0,62). Các phân đoạn có tổng hàm lượng phenolic cao có khả năng chống oxy hóa cao trong cả hai xét nghiệm DPPH và ABTS.

Xác định các hợp chất hoạt tính sinh học bằng GC-MS và ESI-MS

Các phân đoạn hoạt tính sinh học bao gồm P1, P4 – P14 được phân tích bởi GC-MS và EIS-MS để tiết lộ sự hiện diện của các hợp chất chính, bao gồm axit hexadecanoic, α-amyrin, β-amyrin, hydrazine carboxaminde, (3β) -D: C-Friedours-7-en-3-ol, fucosterol, β-sitosterol, phytol, dihydroxylacetone, rutin, glycerin, 2′-hydroxyacetophenone và 2-hydroxy-1-ethyl ester (Bảng 4).

Diện tích đỉnh (%) được sử dụng để so sánh nồng độ của các hợp chất được phát hiện trong mỗi phần. Người ta thấy rằng sự hiện diện và nồng độ của các thành phần được xác định là khác nhau giữa các phần P1 và P4–P14.

Trong số các phân đoạn này, cả α-amyrin và β-amyrin đều cho thấy nồng độ tối đa trong P1 và P4 (25,56–57,67%). β-amyrin trong P5 và P7 chiếm số lượng lớn hơn α-amyrin, tuy nhiên, α-amyrin chiếm 31,74% trong P8, trong khi không có dấu vết của β-amyrin được quan sát thấy trong phân số. Tuy nhiên, cả α-amyrin và β-amyrin đều không được phát hiện trong các phân đoạn P9 – P14 (Bảng 4).

Với ngoại trừ P1, hợp chất hydrazine carboxamide được tìm thấy trong tất cả các phân đoạn P4–14. Phân số P4 cho thấy nồng độ tối đa (38,64%), tiếp theo là P13 (21,43%), trong khi các phân đoạn khác cho thấy số lượng thấp hơn (1,84–13,75%) (Bảng 4).

Axit hexadecenoic chỉ được xác định trong P1, P10 và P11, trong đó P10 có số lượng nhiều hơn (13,09%). Các hợp chất chính khác bao gồm fucosterol (43,62%, P5), (3β) -D: C-Friedours-7-en-3-ol (29,3%, P5), rutin (7,45%, 12,46% và 7,43% trong P9, P10, và P13, tương ứng), và 2-hydroxy-1-etyl este (20,22%, P13) (Bảng 4). Các hóa chất được xác định khác chiếm số lượng thấp hơn nhiều (<5%).

Bảng 4. Thành phần hóa học trong các phân đoạn P1-P14

THẢO LUẬN

Theo các nghiên cứu trước đây, C. hindsii có tác dụng chống ung thư và chống viêm các hoạt động [2–4]. Tuy nhiên, đây là nghiên cứu đầu tiên mô tả tiềm năng TPC và TFC của C. hindsii.

Tổng hàm lượng phenolic và tổng số flavonoid của cây C. hindsii có thể đóng góp quan trọng vai trò trong các hoạt động sinh học mạnh mẽ của chúng. Việc xác định hoạt tính chống oxy hóa rất quan trọng trong việc ước tính thuốc và tiềm năng dược phẩm của một nhà máy.

Qua nghiên cứu đã cho thấy, DPPH và ABTS có hoạt động mạnh nhất trong phần etyl axetat, tiếp theo là dung dịch nước, trong khi hexan không có hoạt tính (Bảng 2). Tương tự, chiết xuất phân đoạn etyl axetat cho thấy TPC tối đa và hoạt động của TFC, trong khi hexan có mức thấp nhất (Bảng 2). Do đó, có thể thấy rằng TPC và TFC tỷ lệ thuận với khả năng chống oxy hóa của C. hindsii.

Ngoài ra, kết quả trong Hình 1 và Hình 2 và Bảng 3 cho thấy rằng các hoạt động chống gốc tự do của DPPH và ABTS tương ứng với độ pha loãng giữa cloroform và metanol. Trong số các mẫu này, tỷ lệ metanol ở mức 50-70% đạt được khả năng chống oxy hóa cao nhất.

Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp GC-MS và ESI-MS, đã phát hiện được 15 hợp chất chính thuộc về axit béo, amit, flavonoid, sterol, terpene, và nhóm phenol. Trong số đó, α-amyrin, β-amyrin, hydrazine carboxamide, hexadecanoic axit, fucosterol, (3β) -D: C-Friedours-7-en-3-ol, rutin, và 2-hydroxy-1-etyl este chiếm tối đa số lượng, trong khi nồng độ của các thành phần khác <5%.

Rutin là một trong những flavonoid dồi dào, đã được nghiên cứu là chất chống oxy hóa tiềm năng của C. hindsii [38,39]. Ngoài ra, hợp chất này đã được báo cáo là có hiệu quả trong điều trị các phản ứng dị ứng [39], viêm, giãn mạch, phát triển khối u, nhiễm trùng do vi khuẩn và vi rút, và nhiễm trùng động vật nguyên sinh [40]. Những các hoạt động dược lý của rutin chủ yếu là do đặc tính chống oxy hóa của nó, đặc biệt là người nhặt rác gốc tự do [41–43].

Kết quả của nghiên cứu này cho thấy rằng C. hindsii chứa nhiều hợp chất hoạt tính sinh học có thể khai thác cho mục đích y tế và dược phẩm.

KẾT LUẬN

• Nghiên cứu này quan sát thấy rằng ethyl acetate là dung môi chiết xuất hiệu quả nhất để chiết xuất tiềm năng chất chống oxy hóa từ C. hindsii.
• Việc sử dụng metanol 50–70% kết hợp với cloroform được cung cấp hoạt động thu dọn gốc DPPH và ABTS tối đa.
• Các phân tích GC-MS và ESI-MS cho thấy sự hiện diện của 15 hợp chất, với các thành phần chính là α-amyrin, β-amyrin, hydrazine carboxamit, axit hexadecanoic, fucosterol, (3β) -D: C-Friedours-7-en-3-ol, rutin, và 2-hydroxy-1-etyl este.

Nguồn: Tran Duc Viet, Tran Dang Xuan, Truong Mai Van, Yusuf Andriana, Ramin Rayee, Hoang-Dung Tran (2019), Comprehensive Fractionation of Antioxidants and GC-MS and ESI-MS Fingerprints of Celastrus hindsii Leaves, Medicines, 6, pp. 64.

Chia sẻ

Chia sẻ

VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol. 36, No. 1, tr. 39-45.

Cây xạ đen được biết đến trong dân gian là một dược liệu có tác dụng trong điều trị ung thư. Trong nghiên cứu này chúng tôi đánh giá tác dụng ức chế một số dòng tế bào ung thư và tác dụng chống oxy hóa của lá xạ đen (Celastrus hindsii Benth et Hook.). Kết quả nghiên cứu này cho thấy cao chiết lá xạ đen có tác dụng ức chế tế bào ung thư và chống oxy hóa cao.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, tỷ lệ mắc các bệnh ung thư đang ngày càng gia tăng và đang ở mức đáng báo động trên thế giới cũng như tại Việt Nam. Ung thư là một bệnh lý ác tính của tế bào. Khi có các tác nhân gây ung thư, các tế bào tăng sinh không kiểm soát được, có khả năng xâm lấn và di căn, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người [1].

Dược liệu là nguồn nguyên liệu dễ kiếm, chi phí rẻ, có tác dụng tốt và ít tác dụng không mong muốn. Xạ đen (Celastrus hindsii Benth et Hook.) là loại dược liệu phân bố nhiều ở Trung Quốc và các nước như Việt Nam, Ấn Độ, Myanma,… Tại Việt Nam, xạ đen phân bố ở các tỉnh như Hòa Bình, Hà Nam, Ninh Bình,… [3].

Xạ đen cũng như nhiều loại cây khác thuộc họ Celastraceae rất giàu các hợp chất như alkaloids, sesquiterpenes, diterpenes, triterpen, glycoside tim và flavonoid; các hợp chất này thể hiện tác dụng diệt khuẩn và chống ung thư in vitro.

Hình ảnh cây Xạ đen Celastrus hindsii Benth et Hook.

Theo y học cổ truyền, Xạ đen có tác dụng thông kinh, lợi niệu. Rễ và vỏ cây được dùng để trị các bệnh kinh nguyệt không đều, bế kinh, viêm thận và các bệnh liên quan đến đường tiết niệu [3]. Hiện nay tại Việt Nam chưa có nhiều bằng chứng khoa học về tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư của cây xạ đen. Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu này để đánh giá tác dụng gây độc tế bào ung thư và tác dụng chống oxy hóa của các phân đoạn dịch chiết lá cây xạ đen.

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu

• Lá xạ đen được thu hái vào tháng 6 năm 2019 tại Buôn Ma Thuột. Mẫu nghiên cứu được giám định thực vật học bởi Bộ môn Dược Liệu và Y học Cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.
• Lá xạ đen sau khi thu hái được rửa sạch, sấy khô ở 50ºC và cắt nhỏ. Tiến hành chiết xuất 1 kg lá xạ đen với dung môi ethanol 90% thu được dịch chiết, lặp lại 3 lần, gộp dịch chiết sau đó lọc. Cô quay thu hồi dung môi, thu được cao toàn phần EtOH (300g). Cao toàn phần EtOH (100g) tiếp tục được chiết phân đoạn như sau: hòa tan cao tổng vào nước sau đó chiết lần lượt bằng các dung môi n-hexane 5 g, EtOAc 32 g và n-Butanol 50 g thu được các phân đoạn dịch chiết. Cô quay thu hồi cắn dịch chiết các phân đoạn để tiến hành thử hoạt tính.

Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp đánh giá khả năng độc tính tế bào

Hoạt tính độc tính tế bào được thực hiện dựa trên phương pháp MTT (3-(4,5 dimethylthiazol-2 – yl )- 2, 5 – diphenyltetrazolium). Đây là phương pháp đánh giá khả năng sống sót của tế bào qua khả năng khử MTT (màu vàng) thành một phức hợp formazan (màu tím) bởi hoạt động của enzym dehydrogenase trong ty thể [6].

Nghiên cứu này chúng tôi tiến hành trên 3 dòng tế bào ung thư: ung thư gan Hep G2 (HB – 8065TM), ung thư phổi LU-1 (HTB – 57TM), ung thư vú MCF-7 (HTB – 22TM).

• Mẫu thử được hòa tan bằng dung môi dimethyl sulfoxid (DMSO) với nồng độ ban đầu là 20 mg/mL.
• Tiến hành pha loãng 2 bước trên đĩa 96 giếng thành 5 dãy nồng độ từ cao xuống thấp lần lượt là 2564; 640; 160; 40 và 10 µg/mL.
• Nồng độ chất thử trong đĩa thử nghiệm tương ứng là 128; 32; 8; 2 và 0,5 µg/mL.
• Chất đối chứng Ellipticine pha trong DMSO với nồng độ 0,01 mM.
• Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm tế bào.
• Tiếp đó, pha tế bào bằng môi trường sạch và điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm (khoảng 1-3×104 tế bào/mL tùy theo từng dòng tế bào).
• Lấy vào mỗi giếng 10 µL chất thử đã chuẩn bị ở trên và 190 µL dung dịch tế bào.
• Đối chứng dương của thí nghiệm là môi trường có chứa tế bào, đối chứng âm chỉ có môi trường nuôi cấy.
• Đĩa thí nghiệm được ủ ở điều kiện tiêu chuẩn. Sau 72 giờ mỗi giếng thí nghiệm được tiếp tục ủ với 10 µL MTT (5 mg/mL) trong 4h.
• Sau khi loại bỏ môi trường, tinh thể formaran được hòa tan bằng 100 µL DMSO 100%.

Kết quả thí nghiệm được xác định bằng giá trị OD đo ở bước song 540 nm trên máy quang phổ Biotek. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Giá trị IC50 được xác định thông qua giá trị % ức chế tế bào phát triển và phần mềm máy tính Rawdata.

% ức chế tế bào = (ODchứng (+) – ODmẫu thử)/( ODchứng (+)– ODchứng (-)) x 100%

Giá trị IC50 của mẫu được tính dựa theo đồ thị nồng độ mẫu thử (C) và phần trăm ức chế (%I).

Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa

Ở nhiệt độ phòng, gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1-picryhydrazyl) ổn định và có màu tím trong dung môi MeOH. Khi có sự có mặt của các chất chống oxy hóa, DPPH sẽ kết hợp với các chất chống oxy hóa này và làm cho dung dịch chuyển sang màu vàng làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của mẫu tại bước song 517 nm.

Tiến hành đo độ hấp thụ tại bước sóng 517 nm để tính toán lượng DPPH còn lại. Thông qua đó đánh giá được khả năng chống oxy hóa của mẫu thử nghiệm so với mẫu đối chứng [7, 8].

• Mẫu thử được pha trong dung môi MeOH thành dãy các nồng độ khác nhau.
• Hỗn hợp phản ứng gồm: 160 µL dung dịch DPPH (nồng độ 0,24 mg/mL pha trong MeOH), 100 µL dịch thử các mẫu và 740 µL MeOH được ủ ở 250C trong 15 phút.
• Song song với mỗi mẫu thử, tiến hành đo mẫu chứng với cùng điều kiện và thành phần gồm: 840 µL MeOH và 160 µL dung dịch DPPH (nồng độ 0,24 mg/mL trong methanol).
• Tất cả các thí
  nghiệm được lặp lại 3 lần.

Hoạt tính quét gốc tự do DPPH được đánh giá thông qua giá trị phần trăm ức chế (%) và được tính theo công thức:

%I = 𝐴𝑐−𝐴𝑡/𝐴𝑐−𝐴0 x 100%

Trong đó:
I %: Hoạt tính chống oxy hóa;
Ac: Độ hấp thu của mẫu chứng;
At: Độ hấp thu của mẫu thử;
A0: Độ hấp thu của mẫu trắng (sử dụng methanol).

Tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết được so sánh với chất chuẩn dương là acid ascorbic. Giá trị IC50 của mẫu được tính dựa theo đồ thị nồng độ mẫu thử (C) và phần trăm ức chế (%I).

Xử lý số liệu

Các số liệu được tổng hợp và phân tích trên máy tính bằng phần mềm Sigma Plot. Các kết quả được biểu diễn dưới dạng X ± SD. X là giá trị trung bình và SD là độ lệch chuẩn.

KẾT QUẢ

Tác dụng độc tính trên các dòng tế bào ung thư

Tác dụng độc tính trên các dòng tế bào ung thư của các phân đoạn dịch chiết lá xạ đen được thể hiện thông qua giá trị IC50 (mg/mL) ở Bảng 1.

Nhận xét: Từ Bảng 1, thuốc đối chứng dương Ellipticine cho thấy tác dụng gây độc rõ rệt đối với cả ba dòng tế bào ung thư gan, phổi và vú với IC50 lần lượt là 0,35 ± 0,02; 0,45 ± 0,03 và 0,58 ± 0,05 (µg/mL). Cao chiết toàn phần EtOH chưa thể hiện tác dụng độc tính với các dòng tế bào ung thư. Phân đoạn EtOAc có tác dụng độc tính với hai dòng tế bào ung thư gan và phổi, với IC50 lần lượt là 33,7 ± 1,5 và 13,0 ± 0,5 µg/mL. Phân đoạn BuOH có khả năng gây độc nhẹ với tế bào ung thư phổi, IC50 là 64,0 ± 2,2 µg/mL.

Tác dụng chống oxy hóa

Để đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các phân đoạn dịch chiết lá cây Xạ đen, chúng tôi tiến hành phương pháp DPPH và thu được kết quả như Bảng 2.

Hình 1. Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc tự do DPPH của acid ascorbic và các phân đoạn của cao chiết lá Xạ đen.

Nhận xét: Từ Bảng 2 và Hình 1, ta thấy phân đoạn EtOAc có tác dụng chống oxy hóa tốt nhất, IC50 là 46,9 ± 2,5 µg/mL. Cao toàn phần EtOH cũng thể hiện tác dụng chống oxy hóa cao với IC50 là 48,5 ± 2,2 µg/mL. Phân đoạn BuOH thể hiện tác dụng chống oxy hóa yếu với IC50 thu được là 113,2 ± 2,9 µg/mL. Song song với mẫu thử tiến hành tương tự với mẫu chứng là acid ascorbic thu được giá trị IC50 là 4,8 ± 0,3 µg/mL.

BÀN LUẬN

Chúng tôi tiến hành phương pháp MTT để đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thư của các phân đoạn của dịch chiết lá Xạ đen.

• Phân đoạn EtOAc cho tác dụng với hai dòng tế bào ung thư gan và phổi có giá trị IC50 lần lượt là 33,68 ± 1,5 µg/mL; và 13,0 ± 0,5 µg/mL.
• Phân đoạn BuOH có tác dụng gây độc nhẹ với dòng tế bào ung thư phổi với IC50 là 64,0 ± 2,2 µg/mL.

Kết quả này tương đồng với các nghiên cứu đã được thực hiện trước đó. Xian-Qing Hu có nghiên cứu dịch chiết cây xạ đen có độc tính tế bào chống lại bốn dòng tế bào ung thư người: tế bào ung thư phổi NCI – H187 với IC50 trong khoảng 14,9 ± 2,1 µg/mL đến 36,8 ± 2,1 µg/mL và ức chế tế bào ung thư đại tràng HCT116 với IC50 trong khoảng 32,9 ± 2,2 µg/mL đến 35,6 ± 2,2 µg/mL, tế bào ung thư vú BC–1 là 19,8 ± 1,8 µg/mL và tế bào ung thư gan HuH7 là 21,2 ± 1,9 µg/mL [9].

Trong báo cáo tổng quan về các thực vật thuộc họ Celastraceae của tác giả Alan C.Spivey thì các chất được tìm thấy trong dịch chiết các phần của cây xạ đen có tác dụng invitro ức chế một số dòng tế bào ung thư ở người như tế bào ung thư vòm họng, ung thử cổ tử cung, ung thư biểu mô đại tràng, ung thư gan,… [10]. Yao Haur Kou và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu đánh giá sinh học lá xạ đen cho thấy hợp chất maytenfolone-A trong lá xạ đen có độc tính tế bào chống lại ung thư gan (HEPA-2B, ED50 = 2,3 µg/mL) và ung thư biểu mô vòm họng (KB, ED50 = 3,8 µg/mL) [5].

Phương pháp quét gốc tự do DPPH là một phương pháp được sử dụng rộng rãi trong mô hình đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các chất vì nó nhanh và đơn giản [7, 11]. Vì thế chúng tôi cũng sử dụng phương pháp DPPH để đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các phân đoạn mẫu thử.  Chất đối chứng chúng tôi sử dụng là acid ascorbic thu được giá trị IC50 của acid ascobic là 4,84 µg/mL tương đồng với các nghiên cứu trước đây [12].  Kết quả nghiên cứu của chúng tôi chỉ ra rằng cao tổng EtOH và phân đoạn EtOAc thể hiện được hoạt tính chống oxy hóa với IC50 lần lượt là 48,45 µg/mL và 46,94 µg/mL. Các thí nghiệm của các tác giả khác cũng có kết quả tương tự nghiên cứu của chúng tôi.

Tác giả Trần Đức Việt chỉ ra được phân đoạn ethylacetate có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất (IC50 là 53,38 ± 0,98 µg/mL) so với các chiết xuất khác, dịch chiết nước IC50 là 108,22 ± 0,48 µg/mL, trong khi chiết xuất hexane không cho thấy bất kỳ hoạt động chống oxy hóa nào [13].

Các tác giả đến từ Đại học Quốc gia Chungnam, Hàn Quốc đã nghiên cứu sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa của các cây thuốc tại Việt Nam. Trong đó, có kết quả chỉ ra rằng cây Xạ đen có tác dụng ức chế quét gốc tự do DPPH với IC50 là 32,3 µg/mL [8].

KẾT LUẬN

• Nghiên cứu của chúng tôi đã đánh giá được tác dụng gây độc tế bào ung thư.
• Phân đoạn EtOAc cho tác dụng mạnh nhất với hai dòng tế bào ung thư gan và phổi với IC50 lần lượt là 33,68 ± 1,5 µg/mL và 13,0 ± 0,5 µg/mL.
• Phân đoạn BuOH có tác dụng yếu hơn với dòng tế bào ung thư phổi với IC50 là 64,0 ± 2,2 µg/mL.
• Phân đoạn EtOAc cũng có tác dụng chống oxy hóa mạnh nhất với IC50 là 46,94 ± 2,54 µg/mL và phân đoạn EtOH có IC50 là 48,45 ± 2,25.

Nguồn: Bùi Thị Thanh Duyên, Đặng Kim Thu, Vũ Mạnh Hùng, Bùi Thanh Tùng (2020), Nghiên cứu tác dụng ức chế tế bào ung thư và chống oxy hóa của lá xạ đen (Celastrus hindsii Benth et Hook.), VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol. 36, No. 1, tr. 39-45.

Chia sẻ

Chia sẻ