Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu tía tô

Nguyễn Thị Hoàng Lan, Bùi Quang Thuật, Lê Danh Tuyên, Nguyễn Thị Ngọc Duyên

Tạp chí Khoa học và Phát triển 2015, tập 13, số 2: 245-250

Nghiên cứu được tiến hành nhằm xác định khả năng kháng khuẩn của tinh dầu lá tía tô đối với 8 chủng vi khuẩn gây hư hỏng và ngộ độc thực phẩm (Escherichia coli, Salmonella, P. fluorescens, P. aeruginosa VTCC-B-657, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Streptococcus feacium). Kết quả cho thấy tinh dầu lá tía tô có khả năng kháng khuẩn đối với tất cả các chủng vi khuẩn nghiên cứu ngoại trừ P. aeruginosa. Tác động của tinh dầu lá tía tô lên vi khuẩn gram dương mạnh hơn lên vi khuẩn gram âm.

---

1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong số hơn 550 loại cây có chứa tinh dầu ở nước ta thì tía tô là một trong những loại cây đang được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Lá tía tô chứa 0,3-1,3% lượng tinh dầu theo chất khô (Yu et al., 2010). Tinh dầu lá tía tô từ lâu đã được con người khai thác và sử dụng vào rất nhiều mục đích khác nhau. Loại  tinh dầu này chứa một số thành phần chủ yếu là perillaldehyde, limonene, á-pinene, â- caryophyllene, linalool và perilla alcohol,… (Đỗ Tất Lợi, 2003; Yu et al., 2010). Chúng được sử dụng trong y học, sản xuất nước hoa, các loại mỹ phẩm, phụ gia thực phẩm.

Hình ảnh cây Tía tô

Tinh dầu chiết xuất từ lá tía tô có tác dụng kháng khuẩn, chống ngộ độc cua cá, giảm triệu chứng trầm cảm, chống ung thư, giải cảm… Tinh dầu lá tía tô có tác dụng kháng khuẩn in vitro đối với các vi sinh vật. Tinh dầu lá tía tô có khả năng ngăn chặn các độc tố đường ruột và triệu chứng ngộ độc do Staphylococcus.

Cho đến nay đã có một số nghiên cứu trong nước về tinh dầu lá tía tô nhưng các tác giả mới chỉ tập trung vào việc xác định thành phần mà chưa có nghiên cứu nào được thực hiện về khả năng kháng khuẩn của tinh dầu lá tía tô. Mục tiêu của nghiên cứu này là xác định khả năng kháng khuẩn của tinh dầu lá tía tô Việt Nam, một loại rau thơm phổ biến của ẩm thực nước ta đồng thời là vị thuốc cổ truyền của y học Việt Nam.

2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

Tinh dầu lá tía tô (Perilla frutescens) được chưng cất từ nguyên liệu lá tía tô thu hái tại Vân Nội – Đông Anh vào thời điểm lúc cây ra hoa rộ.

• Các chủng vi khuẩn được sử dụng: Escherichia coli, Salmonella, P. fluorescens, P. aeruginosa VTCC-B-657, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Streptococcus feacium.
• Môi trường MHA (Mueller-Hilton Agar), xuất xứ Đức được dùng làm môi trường thử nghiệm. Thành phần môi trường: Infusion from meat 2 g/l, casein hydrolysate 17,5 g/l, NaCl 1,5 g/l, agar 17 g/l, pH (25oC) = 7,3 ± 0,2.
• Môi trường TSB (Trypticase Soy Broth) dùng làm môi trường tăng sinh vi khuẩn thử nghiệm. Thành phần môi trường: trypticase peptone 17 g/l, phytone peptone 3 g/l, NaCl 5 g/l, K2HPO4 2,5 g/l, glucose 2,5 g/l, pH (25oC) = 7,3 ± 0,2.

Phương pháp

Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu bằng phương pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn

– Chuẩn bị dịch vi khuẩn:

• Cấy ria tạo khuẩn lạc trên môi trường thạch MHA, vi khuẩn được tồn trữ trong ống thạch nghiêng và bảo quản lạnh ở 4oC.
• Từ ống tồn trữ, chọn 2-3 khuẩn lạc đưa vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường TSB đã khử trùng, nuôi cấy tĩnh ở 37oC (riêng P. fluorescens nuôi ở 30oC) trong 16 – 18h (riêng Staphylococcus aureus nuôi trong 24h).

Mật độ vi khuẩn sau khi nuôi cấy trong môi trường TSB được xác định theo phương pháp đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 625nm

– Tiến hành:

• Dùng pipet man hút 100µl vi khuẩn mỗi loại (mật độ tế bào 106 CFU/ml), sau đó chang đều trên mặt thạch MHA đã khô ổn định, chờ khô bề mặt.
• Đĩa giấy 6mm vô trùng được thấm bão hòa tinh dầu nguyên chất, dung dịch 5% tinh dầu và chờ khô rồi đặt lên mặt thạch đã chang vi khuẩn, đè nhẹ để đĩa giấy cố định trên mặt thạch.
• Đĩa giấy ở giữa thấm dung dịch đối chứng, các đĩa xung quanh thấm tinh dầu nguyên chất và dung dịch 5% .
• Chuyển các đĩa petri vào tủ lạnh (10oC) khoảng 4 – 8h để tinh dầu khuếch tán ra thạch. Sau đó đem nuôi ở 37oC trong 16 – 18h, riêng Staphylococcus aureus nuôi trong 24h, P. fluorescens nuôi ở 30oC/16 – 18h.
• Đọc kết quả và ghi nhận đường kính vòng vô khuẩn. Đường kính vòng vô khuẩn (D-d) được xác định bằng đường kính vòng kháng ngoài trừ đi đường kính đĩa giấy.

Xác định MIC(Minimum Inhibitory Concentration) theo phương pháp hòa tan trong môi trường lỏng TSB

• Pha dung dịch đối chứng và pha tinh dầu thành dãy nồng độ cần thử. Dãy nồng độ tinh dầu cần thử: 128 µg/ml, 256 µg/ml, 512 µg/ml, 1.024 µ g/ml, 2.048 µg/ml, 4.096 µg/ml, 8.192 µg/ml.
• Dùng pipet man hút tinh dầu đã pha loãng theo dãy nồng độ thử và dung dịch đối chứng vào các ống nghiệm đã chuẩn bị sẵn môi trường. Lắc đều cho tinh dầu và dung dịch đối chứng hòa tan đều vào môi trường.
• Dùng pipet man hút 20µl dịch vi khuẩn đã chuẩn bị đưa vào các ống nghiệm. Nuôi ở 37oC trong 16 – 18h, riêng Staphylococcus aureus nuôi trong 24h, P. fluorescens nuôi ở 30oC/16 – 18h.
• Đọc kết quả, tìm MIC của tinh dầu cho từng loại vi khuẩn.

Xử lý số liệu

Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên và được lặp lại 03 lần. Số liệu thí nghiệm thu được xử lý thống kê bằng phần mềm Excel 2007. Phân tích phương sai và so sánh các trung bình ở mức ý nghĩa á = 5% bằng phần mềm SAS 9.1.

3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu bằng phương pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn

Tinh dầu nguyên chất

Với thử nghiệm tinh dầu nguyên chất, kết quả cho thấy 5/8 chủng vi khuẩn khảo sát bị ức chế hoàn toàn (vi khuẩn không mọc trên toàn đĩa thạch).

• Điều này có thể được giải thích bởi khả năng khuếch tán khá mạnh của tinh dầu trên bề mặt thạch cùng với đặc tính dễ bay hơi của tinh dầu ở nhiệt độ thường, hơi của tinh dầu nguyên chất không thoát ra khỏi đĩa petri đã làm ức chế hoàn toàn sự phát triển của đa số các vi khuẩn khảo sát.

Các chủng Escherichia coli, Salmonella, P. aeruginosa mọc bình thường, tại những vị trí đặt đĩa giấy tẩm tinh dầu nguyên chất hình thành vòng kháng khuẩn, riêng P. aeruginosa không hình thành vòng kháng. Vòng kháng khuẩn đo được tương đối nhỏ và đồng đều nhau ở mỗi lần thử nghiệm, với Escherichia coli đường kính vòng kháng đo được là 5,26mm, với Salmonella đường kính vòng kháng đo được là 4,3mm.

Kết quả bước đầu cho thấy tác động của tinh dầu lên vi khuẩn gram dương mạnh hơn lên vi khuẩn gram âm.

• Tất cả các vi khuẩn gram dương bị ức chế hoàn toàn bởi tinh dầu lá tía tô nguyên chất (vi khuẩn không mọc trên toàn đĩa thạch).
• Điều này có thể được giải thích bởi sự khác nhau của thành tế bào của hai loại vi khuẩn gram âm và vi khuẩn gram dương . Thành tế bào gram dương gồm một lớp Peptidoglycan dày bao bên ngoài màng sinh chất (Plasma membrane).

Thành tế bào gram âm phức tạp hơn với lớp Peptidoglycan mỏng, cách một lớp không gian chu chất (Periplasmic space) và tới lớp màng ngoài (Outer membrane) là phức hợp lipoprotein và lipopolysaccharide. Chính cấu trúc nhiều lớp này đã bảo vệ tế bào vi khuẩn gram âm trước tác động của tinh dầu và khoảng không gian chu chất chứa độc tố và enzyme có thể làm mất tác dụng của tinh dầu trước khi tác dụng lên màng sinh chất. Kết quả của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của Yu và cộng sự (2010) về khả năng kháng khuẩn của tinh dầu lá tía tô trên một số chủng Staphylococcus aureus.

Tinh dầu 5%

Tiến hành thử nghiệm với dung dịch tinh dầu 5%, tất cả các chủng vi khuẩn nghiên cứu mọc bình thường và mọc đều trên mặt thạch.

Tại những chỗ đặt đĩa giấy tẩm dung dịch tinh dầu lá tía tô 5% không hình thành vòng kháng đối với 3/4 chủng vi khuẩn gram âm nghiên cứu, riêng P. fluorescens hình thành đường kính vòng kháng tương đối lớn là 9,58mm. Tất cả các chủng vi khuẩn gram dương nghiên cứu đều hình thành vòng kháng. Tuy nhiên đường kính đo được tương đối nhỏ nhưng đồng đều ở mỗi lần thử nghiệm.

• Đường kính vòng kháng khuẩn đối với Bacillus cereus là 4,43mm, Bacillus subtilis là 4,21mm, Streptococcus feacium là 5,2mm. Dung dịch tinh dầu 5% có tác dụng mạnh đối với Staphylococcus aureus, đường kính vòng kháng khuẩn đo được lớn nhất là 14,42mm.

Các kết quả trên đây cho thấy một lần nữa sự tác động của tinh dầu lá tía tô lên vi khuẩn gram âm và vi khuẩn gram dương là khác nhau. Tác động của tinh dầu lá tía tô 5% lên vi khuẩn gram dương mạnh hơn vi khuẩn gram âm.

Xác định MIC của tinh dầu tía tô

Chúng tôi tiến hành xác định MIC cho tất cả các chủng vi khuẩn nghiên cứu, loại trừ P. aeruginosa vì tinh dầu nguyên chất đã không kháng được. Kết quả chỉ có ý nghĩa khi ống nghiệm đối chứng vi khuẩn mọc bình thường.

Giá trị MIC của tinh dầu lá tía tô trên các chủng vi khuẩn nghiên cứu được thể hiện trên bảng 3 và bảng 4. Thông qua kết quả khảo sát có thể nhận thấy rằng MIC của tinh dầu lá tía tô đối với 2 chủng vi khuẩn gram âm là Escherichia coli và Salmonella > 8.192 µg/ml, với các chủng khác và cao hơn so với tinh dầu lá kinh giới.

• Riêng đối với Staphylococcus aureus, một loại vi khuẩn gram dương gây ngộ độc thực phẩm, chỉ cần một nồng độ tinh dầu lá tía tô khá thấp khoảng 1.024 µg/ml là có thể ức chế được. Các chủng còn lại có MIC từ 2.048 – 4.096 µg/m

4. KẾT LUẬN

Tinh dầu lá tía tô có khả năng kháng khuẩn đối với tất cả các chủng vi khuẩn nghiên cứu ngoại trừ P. aeruginosa. Tác động của tinh dầu lá tía tô lên vi khuẩn gram dương rõ hơn lên vi khuẩn gram âm. Tinh dầu nguyên chất ức chế hoàn toàn 4 chủng vi khuẩn gram dương nghiên cứu là Bacillus cereus, Bacillus subtilis,
Staphylococcus aureus, Streptococcus feaium (vi khuẩn không mọc trên toàn đĩa thạch) và chỉ ức chế hoàn toàn được 1 chủng vi khuẩn gram âm nghiên cứu là P. fluorescens.

Tinh dầu lá tía tô 5% ức chế mạnh các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, P. fluorescens với đường kính vòng kháng tương đối lớn lên đến 14,12mm và 9,58mm, trong khi đó lại có tác dụng kém hơn trên các chủng vi khuẩn Bacillus cereus, Bacillus subtilis và Streptococcus feaium với đường kính vòng kháng tương đối nhỏ.

Nồng độ tinh dầu tối thiểu ức chế sự phát triển của các chủng vi khuẩn nghiên cứu chủ yếu nằm trong dãy nồng độ tinh dầu thử nghiệm, từ 1.024 – 4.096 µg/ml. Riêng MIC của 2 chủng Escherichia coli và Salmonella là > 8.192 µg/ml, nằm ngoài dãy nồng độ thử nghiệm.