Đái Thị Xuân Trang, Lâm Hồng Bảo Ngọc và Võ Thị Tú Anh
Tap chı́ Khoa hoc Trường Đai học Cần Thơ Phần A: Khoa học Tự nhiên, Công nghệ và Môi trường: 40 (2015): 1-6
Kết quả chứng minh hiệu quả kháng khuẩn của cao methanol cây Hà Thủ Ô rất cao ở giá trị MIC =16 µg/ml đối với 2 dòng vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus. Cao chiết methanol cây Hà Thủ Ô có khả năng kháng vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus cao hơn thuốc kháng sinh chuẩn ampicillin (MIC = 64 µg/ml) và amoxicillin (MICE. coli = 64 µg/ml và MICS. aureus = 16 µg/ml). Hiệu quả loại bỏ gốc tự do hydro ở DPPH của cao Hà Thủ Ô (IC50 = 349,35 µg/ml) thấp hơn so với vitamin C 15,5 lần (IC50 = 22,55 µg/ml).
Mục lục
GIỚI THIỆU
Cây Hà Thủ Ô trắng (Streptocaulon juventas Merr.) và các bộ phận của cây được các nhà khoa học quan tâm trong những năm gần đây. Các thử nghiệm về hoạt tính kháng ung thư cho thấy dịch chiết methanol rễ cây Hà Thủ Ô trắng có độc tính chọn lọc đối với năm dòng tế bào ung thư là tế bào ung thư tử cung Hela người, tế bào ung thư phổi người A549, tế bào ung thư chuột colon 26-L5, tế bào ung thư phổi chuột LLC và tế bào ung thư ruột kết chuột B16-BL6 chuột (Ueda et al., 2002). Dịch chiết của Hà Thủ Ô (cả cây) có khả năng kháng khuẩn (Quang-Vinh and Jong-Ban, 2013) và kháng oxy hóa (Quang-Vinh and Jong-Ban, 2011). Trong
nghiên cứu này, thành phần sử dụng của cây Hà Thủ Ô là thân và lá với mục đích khảo sát khả năng kháng khuẩn và kháng oxy hóa.
Hình ảnh cây Hà thủ ô trắng
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
- Vật liệu thí nghiệm là cây Hà Thủ Ô trắng (Streptocaulon juventas Merr.) được thu hái ở Bến Tre. Cây Hà Thủ Ô sau khi thu mẫu được đem về phòng thí nghiệm và định danh theo Phạm Hoàng Hộ (2003).
- Các chủng vi khuẩn được sử dụng trong thử nghiệm bao gồm vi khuẩn Escherichia coli, Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa do Trung tâm kiểm nghiệm thuốc – mỹ phẩm – dược phẩm Cần Thơ cung cấp.
Phương pháp
Điều chế cao methanol cây Hà Thủ Ô
Bột thô thân và lá cây Hà Thủ Ô (500 g) được ngâm trong methanol 48 giờ, sau đó hỗn hợp được cô quay áp suất thấp, thu được cao methanol ở dạng sệt.
Khảo sát sự kháng khuẩn của cao methanol Hà Thủ Ô
Chuẩn bị cao chiết:
- Cao chiết được pha với dung môi methanol thành các nồng độ 8, 16, 32, 64, 128 µg/ml.
- Dịch nuôi vi khuẩn được pha loãng trong nước muối sinh lý tương đương độ đục ≥ 0,5 Mc Farland mật số vi khuẩn là 108 được trải đều trên môi trường LB đặc.
- Đĩa thạch được để khô 15 phút trước khi đặt khoanh giấy có tẩm cao Hà Thủ Ô.
Cao chiết Hà Thủ Ô ở các nồng độ khảo sát khác nhau (100 µl) được cho lên khoanh giấy (đường kính 6 mm) vô trùng.
Các kháng sinh ampicillin và amoxicillin được sử dụng như đối chứng dương và được pha thành các nồng độ tương tự như cao chiết.
Ngoài ra, do sử dụng methanol để pha cao chiết nên ảnh hưởng của methanol lên sự phát triển của vi khuẩn cũng được khảo sát. Mỗi đĩa thạch được đặt từ 1, 2 hay 3 khoanh giấy tẩm cao chiết, sau đó để khô.
- Các nồng độ 8, 16, 32, 64, 128 µg/ml được sử dụng trong khảo sát, mỗi nồng độ được lặp lại 3 lần.
- Các đĩa thạch được ủ ở 32ºC trong 24 – 48 giờ. Đường kính vùng ức chế được đo bằng thước đo đơn vị mm.
Khảo sát khả năng kháng oxy hóa DPPH
Khả năng kháng oxy hóa của cao chiết methanol cây Hà Thủ Ô trắng được thực hiện theo phương pháp DPPH (2,2 – Diphenyl – 1 – picrylhydrazyl) như sau:
- Cao methanol Hà Thủ Ô được pha thành các nồng độ 100, 200, 300, 400, 500 µg/ml trong methanol.
- Lượng cao chiết được pha vào phản ứng là 100 µl và DPPH 6×10-4 M là 100 µl (mỗi nồng độ lặp lại 3 lần).
- Hỗn hợp phản ứng được ủ trong 60 phút trong tối, sau đó được đo độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 517 nm.
- Khả năng kháng oxy hóa được tính dựa vào hiệu suất phản ứng và hàm lượng chất kháng oxy hóa tính tương đương vitamin C.
Thống kê phân tích số liệu
Kết quả được xử lý thống kê theo phương pháp phân tích Anova bằng phần mềm Minitab 16.0 và đồ thị được biểu diễn bằng phần mềm Microsoft Excel.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Điều chế cao methanol cây Hà Thủ Ô
Cao methanol cây Hà Thủ Ô sau khi cô quay thu được 20,04 g cao dạng sệt với hiệu suất chiết cao là 3,55% (so với trọng lượng khô).
Khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao methanol cây Hà Thủ Ô
Khả năng kháng khuẩn của cao Hà Thủ Ô được xác định dựa trên khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn thể hiện qua đường kính vòng kháng khuẩn được tạo ra trên đĩa petri được trình bày ở Hình 1 và Hình 2.
Kết quả mô tả ở Hình 1 cho thấy cao Hà Thủ Ô có khả năng kháng khuẩn đối với hai dòng vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus, đường kính vòng vô khuẩn được tạo ra ở nồng độ cao khảo sát rất thấp (< 16 μg/ml). Ngược lại, cao Hà Thủ Ô không có khả năng kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa (vẫn có vòng vô khuẩn nhưng khuẩn lạc phát triển khắp vòng Hình 1C).
Xét một cách tổng thể về khả năng kháng khuẩn của cao methanol Hà Thủ Ô đối với hai dòng vi khuẩn E. coli và S. aureus cho thấy cao Hà Thủ Ô có khả năng ức chế sự phát triển vi khuẩn E.coli cao hơn vi khuẩn S. aureus một cách khác biệt có ý nghĩa thống kê ở nồng độ khảo sát từ 16 μg/ml đến 128 μg/ml
Hiệu quả kháng khuẩn của cao Hà Thủ Ô đối với chủng vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus trình bày ở Bảng 1.
Kết quả cho thấy đường kính vòng kháng khuẩn tỉ lệ thuận với nồng độ cao Hà Thủ Ô; nghĩa là khả năng kháng khuẩn của cao Hà Thủ Ô tăng khi tăng nồng độ cao chiết.
- Hiệu quả kháng khuẩn của cao Hà Thủ Ô đối với chủng vi khuẩn E. coli cao hơn khác biệt có ý nghĩa thống kê so với vi khuẩn S. aureus ở tất cả các nồng độ khảo sát (Bảng 1).
- So sánh về độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh thì vi khuẩn E. coli và S. aureus nhạy cảm với cao Hà Thủ Ô hơn so với kháng sinh ampicillin. Ở nồng độ 16 µg/ml, cao Hà Thủ Ô có hoạt tính ức chế cao với 2 chủng vi khuẩn E. coli và S. aureus tạo vòng vô khuẩn rõ rệt, lần lượt là 25,3 ± 0,6 mm và 22,7 ± 0,6 mm (Bảng 1), trong khi đó kháng sinh ampicillin không ức chế hai dòng vi khuẩn này ở nồng độ 16 µg/ml (Hình 3). Sự nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh là rất quan trọng để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn.
Trong nghiên cứu này cho thấy hai dòng vi khuẩn khảo sát đều nhạy cảm với cao Hà Thủ Ô, điều này chứng minh rằng các thảo dược có thể thay thế các kháng sinh thương mại nhưng mức độ an toàn cao hơn.
So sánh khả năng kháng khuẩn của cao methanol Hà Thủ Ô với thuốc kháng sinh thương mại được sử dụng là ampicillin và amoxicillin được trình bày ở Hình 3.
- Biểu đồ trình bày ở Hình 3A cho thấy, khả năng kháng vi khuẩn E. coli của cao Hà Thủ Ô cao hơn so với hai loại kháng sinh chuẩn amipicillin và amoxicillin ở tất cả nồng độ khảo sát.
- Biểu đồ trình bày ở Hình 3B cho thấy, khả năng kháng vi khuẩn S. aureus của cao Hà Thủ Ô cao hơn kháng sinh ampicillin ở tất cả nồng độ khảo sát.
- Tuy nhiên, cao Hà Thủ Ô có khả năng kháng vi khuẩn S. aureus thấp hơn kháng sinh amoxcillin khi khảo sát ở nồng độ từ 32 µg/ml đến 128 µg/ml.
Khả năng kháng khuẩn của cao Hà Thủ Ô được xác định dựa trên giá trị MIC (minimum inhibitory concentration).
Nồng độ ức chế tối thiểu là nồng độ cao chiết (hoặc kháng sinh) thấp nhất mà tại đó xuất hiện vòng vô khuẩn; nên nồng độ ức chế tối thiểu càng thấp thì khả năng kháng khuẩn càng cao. Ta thấy, nồng độ ức chế tối thiểu của cao Hà Thủ Ô ở hai chủng vi khuẩn E. coli và S. aureus bằng nhau và bằng 16 µg/ml, cao Hà Thủ Ô không có tác dụng kháng vi khuẩn P. aeruginosa. Khả năng kháng hai chủng vi khuẩn E. coli và S. aureus của ampicillin (MIC = 64 µg/ml) thấp hơn so với cao Hà Thủ Ô (MIC = 16 µg/ml).
Kháng sinh ampicillin có khả năng kháng P. aeruginosa (MIC = 64 µg/ml), trong khi cao Hà Thủ Ô không có khả năng kháng chủng vi khuẩn này. Kháng sinh amoxicillin có khả năng kháng khuẩn trên ba dòng vi khuẩn khảo sát là E. coli, S. aureus và P.aeruginosa với giá trị MIC lần lượt là 64 µg/ml, 16 µg/ml và 64 µg/ml.
- Kết quả cho thấy, khả năng kháng vi khuẩn E. coli và S. aureus của cao Hà Thủ Ô (MIC = 16 µg/ml) cao
hơn kháng sinh amoxicillin. - Kết quả có thể chứng minh khả năng kháng khuẩn của cao Hà Thủ Ô cao hơn gấp 4 lần so với kháng sinh ampicillin trên hai dòng vi khuẩn E. coli và S. aureus.
- Cao methanol cây Hà Thủ Ô có hiệu quả kháng vi khuẩn E. coli cao gấp 4 lần so với kháng sinh amoxicillin.
- Hiệu quả kháng vi khuẩn S. aureus của cao Hà Thủ Ô tương đương với kháng sinh amoxicillin.
Khảo sát khả năng làm sạch gốc tự do DPPH của cao chiết cây Hà Thủ Ô
Khả năng kháng oxy hóa của cao Hà Thủ Ô được khảo sát dựa trên hàm lượng chất kháng oxy hóa. Hàm lượng chất kháng oxy hóa được tính tương đương µg/ml vitamin C dựa vào phương trình đường chuẩn y = -0,029x + 1,3311 (R2 = 0,9897).
Kết quả kháng oxy hóa của cao methanol cây Hà Thủ Ô được trình bày trong Bảng 3 cho thấy, hiệu suất kháng oxy hóa của cao Hà Thủ Ô tỉ lệ thuận với nồng độ cao và khác biệt có ý nghĩa thống kê ở các nồng độ khảo sát. Hiệu suất kháng oxy hóa của cao Hà Thủ Ô cao nhất là 72,07% ở nồng độ 500 µg/ml.
Kết quả hàm lượng chất kháng oxy hóa có trong cao Hà Thủ Ô được tính dựa vào phương trình đường chuẩn viatmin C (y = -0,029x + 1,3311) được trình bày ở Bảng 3.
- Kết quả trình bày ở Bảng 3 cho thấy, nồng độ cao từ 0 đến 500 µg/ml có lượng vitamin C tương ứng tăng dần từ 0 đến 33,15 ± 0,86 µg/ml.
- Nồng độ cao methanol Hà Thủ Ô cao nhất 500 µg/ml tương ứng với 33,15 ± 0,86 µg/ml vitamin C và 100 µg/ml là nồng độ thấp nhất với lượng vitamin C tương ứng 9,8 ± 0,52 µg/ml.
Kết quả nghiên cứu này chứng minh cao Hà Thủ Ô có khả năng kháng oxy hóa cao hơn một số thảo dược trong các nghiên cứu trước đây như cây Nhàu (Morinda citrifolia L.) gồm cao ethanol lá, trái xanh, rễ cây Nhàu với giá trị IC50 lần lượt là 917,16 µg/ml, 1025,2 µg/ml và 1531,4 µg/ml (Đái Thị Xuân Trang và ctv, 2012); cây Cà gai leo (Solanum hainanense Hance) IC50 là 1734 µg/ml và cao Hà Thủ Ô (Streptocaulon juventas Merr.) (cả cây) có khả năng kháng oxy hóa với giá trị là IC50 = 2586 µg/ml (Quang- Vinh and Jong-Ban, 2011).
KẾT LUẬN
- Cao methanol Hà Thủ Ô trắng (thân và lá) có khả năng kháng hai loại vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus cao hơn thuốc kháng sinh thương mại ampicillin và amoxicillin.
- Cao methanol Hà Thủ Ô trắng không có khả năng kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa ở các nồng độ khảo sát.
- Cao methanol Hà Thủ Ô có khả năng kháng oxy hóa trong phương pháp DPPH với giá trị IC50 = 349 µg/ml thấp hơn vitamin C (IC50 = 22,55 µg/ml) 15,5 lần.
