Bùi Lê Thanh Nhàn, Nguyễn Bảo Hưng, Nguyễn Thị Thu Hiền, Hoàng Tấn Quảng, Trương Thị Bích Phượng
Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 2020
Mục lục
TÓM TẮT
Lycorine là một hoạt chất có trong cây sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) được nghiên cứu nhiều trong lĩnh vực dược liệu do cấu trúc hóa học và chức năng sinh học đa dạng, cũng như tác dụng dược lý trên các bệnh khác nhau. Để khảo sát lượng lycorin trong một số mẫu sâm cau tự nhiên trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế, chúng tôi đã tiến hành phân tích trên hệ thống HPLC-FD được trang bị đầu dò huỳnh quang. Với phương pháp sắc ký này, kết quả thu được các peak tách tốt, thời gian lưu ổn định. Phương pháp có sự phụ thuộc tuyến tính của đáp ứng với nồng độ chất phân tích với hệ số tương quan hồi quy ≥ 0.997 (hay R2 ≈ 0.9982) đạt yêu cầu định lượng.
MỞ ĐẦU
Lycorine là thành phần hoạt tính chính của nhiều họ thực vật và là một trong những alkaloid điển hình với lõi
nhân pyrrolophenanthridine. Lycorine là alkaloid được phân lập đầu tiên từ Narcissus peseudonarcissus vào năm 1877 (Qiuyue et al., 2014).
Nghiên cứu dược lý hiện đại cho thấy lycorine không chỉ có khả năng chống viêm, mà còn có khả năng ức chế acetylcholinesterase, sốt rét kháng kiềm, bảo vệ tim mạch và một loạt các tế bào apoptosis gây ra bởi kiềm (Delphine et al., 2010; Cao et al., 2013). Lycorine cũng có hoạt tính kháng virus rộng, điển hình như virus SARS, virus herpes simplex, virus vaccinia, virus Punta Toro và virus sốt Rift Valley (Delphine et al., 2010; Qiuyue et al., 2014; Brintha et al., 2017). Mặt khác, nghiên cứu về lycorine và các dẫn xuất của nó cũng cũng cho thấy sự thúc đẩy tiến độ trong quá trình điều trị các bệnh như ung thư, bệnh Alzheimer, nhiễm virus và các tác hại nghiêm trọng khác đối với sức khỏe con người. Đáng chú ý, lycorine thể hiện nhiều tác dụng dược lý trên nhiều bệnh khác nhau với độc tính rất thấp và tác dụng phụ nhẹ; Cấu trúc hóa học phong phú với nhiều dẫn xuất khác nhau, vì vậy lycorine được xem là một dược chất tiềm năng (Cao et al., 2013; Jiangning et al., 2011; Jia et al., 2018; Peng et al., 2014).
Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.)
Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thuộc Chi Cồ nốc (Curculigo), họ Tỏi voi lùn (Hypoxidaceae). Curculigo orchioides Gaertn. (C. orchioides Gaertn.) còn được gọi là Kali musli, là loài thảo dược đã được người dân ở nhiều nước trên thế giới (như Ấn Độ, Nepal, Philippin…) sử dụng từ lâu như là một thần dược của sự sống (Brintha et al., 2017; Mohammad et al., 2010).
Các nghiên cứu, phân tích sàng lọc hóa sinh trên chiết xuất của C. orchioides Gaertn cho thấy sự hiện diện của nhiều loại dược chất khác nhau như glycoside, saponin, tannin, protein, acid amine và alkaloid… (Cao et al., 2008; Cao et al., 2016; Yan et al., 2013). Alkaloid cũng được xác định có sự hiện diện trong sâm cau (Rao et al., 1978). Phân tích mẫu rễ củ của cây sâm cau phân bố tại Ấn Độ, các nhà khoa học thấy có sự hiện diện của alkaloid và lycorine (Mohammad et al., 2010). Sử dụng phần mềm ChemDraw để tiến hành phân tích, nhận dạng các thành phần dược chất có trong sâm cau từ nguồn dữ liệu thu thập ở Trung Quốc đã nhận diện được 77 loại dược chất, trong đó có lycorine (Brintha et al., 2017).
Tiềm năng của lycorine đối với cuộc sống con người là rất lớn. Mặc dù vậy, dữ liệu nghiên cứu về dược chất này tại Việt Nam vẫn chưa toàn diện. Do đó, để đóng góp thêm những thông tin, tư liệu khoa học về cây sâm cũng như xác định chất lycorine từ cây sâm cau, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu về hàm lượng lycorine ở cây sâm cau trên địa bàn Thừa Thiên Huế.
Xem thêm: Công dụng và cách dùng của sâm cau, vị thuốc quý của mọi nhà
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Nguyên liệu
Cây sâm cau được thu hái tự nhiên tại vùng núi Ngự Bình, Tỉnh Thừa Thiên Huế, Việt Nam. Toàn bộ cây sâm
cau mới thu hái được rửa sạch dưới vòi nước, sau đó tách riêng các bộ phân lá và rễ củ của cây sâm cau thành các phần riêng biệt; thái nhỏ và sấy khô ở 65oC đến trọng lượng không đổi. Các bộ phận của cây được nghiền riêng biệt thành bột mịn để tiến hành thí nghiệm.
Phương pháp nghiên cứu
Tách chiết với dung môi nước khử ion:
- Cân 0,2 – 1 g mẫu bột dược liệu trộn với 40 mL nước khử ion dùng làm dung môi chiết với chất chuẩn lycorine nồng độ 1 mg/mL ở các ngưỡng nhiệt độ khác nhau: 4oC, 25oC, 37oC, 65oC trong các thời gian 10 phút, 30 phút, 2 giờ, 5 giờ.
- Dịch chiết Lycorin được lọc qua màng lọc Minissart 0,45 µm (Sartorius, Đức) để loại bỏ tạp bẩn có thể gây hư hỏng hay tắc cột HPLC.
- Sau đó, dịch lọc được pha loãng 20 lần với nước khử ion trước khi tiến hành thí nghiệm HPLC.
Phân tích HPLC:
- Mẫu sau khi được phân tích trên hệ thống HPLC của Thermo Electron (Mỹ) với phần mềm ChromQuest.
- Điều kiện chạy HPLC là: thể tích vào mẫu: 20 µL, pha động: CH3OH: KH2PO4 (15 mM, pH 6.35) (50:50, v/v), tốc độ dòng: 0,8 ml/phút, bước sóng: 285 – 320 nm, thời gian phản ứng: 10 phút, nhiệt độ cột: 30oC.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Phương trình đường chuẩn
Tiến hành phân tích mẫu chuẩn lycorine của cây sâm cau ở nồng độ khác nhau (mẫu chuẩn được pha trong
dung dịch methanol). Kết quả Speak thu được sau khi chạy HPLC với thang nồng độ lycorine từ 0,1 – 10 ppm lần lượt là: 28,13409; 61,58854; 201,26494; 1443,55212, cụ thể được trình bày ở bảng 1.
Nhận xét:
- Dựa vào kết quả phân tích HPLC của mẫu chuẩn lycorine được pha loãng ở các nồng độ khác nhau, ta thấy
nồng độ ảnh hưởng tới diện tích peak và thời gian lưu của mẫu phân tích trên các cột sắc kí. - Nồng độ càng cao thì hàm lượng lycorine càng lớn, nồng độ nhỏ sẽ kéo dài thời gian lưu.
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng lycorine
Dịch chiết lycorine từ mẫu sâm cau thu ngoài tự nhiên được sử dụng với hàm lượng 0,2 g/40 mL (mẫu/nước khử ion). Kết quả thu được, trình bày ở hình 5.
Từ phương trình đường chuẩn của mẫu chuẩn ở bảng 1 chúng tôi tiến hành khảo sát hàm lượng lycorine của
mẫu chiết ở các nhiệt độ khác nhau, kết quả được trình bày ở bảng 2.
Nhận xét:
Qua các kết quả phân tích và số liệu thống kê ở bảng 2 cho thấy, ở nhiệt độ 4oC/30 phút hàm lượng lycorine cao nhất đạt 2,19 (ppm). Vậy nhiệt độ chiết tốt nhất là 4oC. Nhiệt độ chiết mẫu càng cao thì hàm lượng lycorine chiết được càng thấp.
Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng lycorine (ở 4oC)
Từ kết quả khảo sát về nhiệt độ tối ưu để thu được dịch chiết lycorine, chúng tôi tiếp tục tiến hành đánh giá ảnh hưởng của yếu tố thời gian đối với hàm lượng lycorine từ mẫu sâm cau thu hái tự nhiên.
Sử dụng dịch chiết với hàm lượng 1 g/40 mL (mẫu/nước khử ion) và phân tích HPLC, kết quả thu được cho thấy ứng với các mốc thời gian 10 phút,30 phút, 120 phút, 300 phút thì diện tích peak của lycorine lần lượt là: 176,838; 49,917; 5,10841; 4,47382. Kết quả được trình bày cụ thể ở bảng 3.
Nhận xét:
Qua các kết quả phân tích và số liệu thống kê ta thấy, hàm lượng lycorine cao nhất đạt 1,09 (ppm) khi thực hiện trong thời gian 10 phút ở 4 oC. Vậy thời gian chiết tối ưu nhất là 10 phút ở nhiệt độ 4 oC.
Khảo sát hàm lượng lycorine ở các bộ phận khác nhau sâm cau
Các dịch chiết lycorine từ lá của mẫu sâm cau thu ngoài tự nhiên được sử dụng với hàm lượng 1g/40mL
(mẫu/nước khử ion) ở nhiệt độ 4 oC trong 10 phút. Kết quả thu được, trình bày ở hình 7.
Nhận xét:
- Qua kết quả phân tích HPLC về hàm lượng lycorine ở lá cây sâm cau ở điều kiện 4oC/ 10 phút thì có diện tích peak bằng 133,294 (mAu*s), tương ứng với nồng độ lycorine bằng 0,79 (ppm). Vậy hàm lượng lycorine ở lá cây sâm cau là tương đối thấp.
- Kết hợp với kết quả phân tích hàm lượng lycorine ở củ cây sâm cau (bảng 3) thì ta thấy hàm lượng lycorine ở lá cây sâm cau thấp hơn hàm lượng lycorine ở củ cây sâm cau (lycorine ở lá: 0,79ppm, lycorine ở củ: 1,09 ppm).
Kết luận
- Như vậy, phương pháp HPLC dùng đầu dò huỳnh quang kết hợp với cột C18 cho độ nhạy phát hiện mẫu cao, độ lặp lại tốt, thích hợp cho việc định lượng hàm lượng lycorine.
- Bên cạnh đó, với kết quả thu được cũng chứng minh trong dịch chiết nước của sâm cau thì hàm lượng lycorine ở củ lớn hơn hàm lượng lycorine ở lá sâm cau.
