Mai Thành Chung, Nguyễn Thị Thu Hương* Trung tâm Sâm và Dược liệu tp. Hồ Chí Minh-Viện Dược liệu
Tạp chí Dược liệu 1/2018
Mục lục
Tóm tắt
Sâm Việt Nam (Sâm Ngọc Linh) là một loại dược liệu quý với các tác dụng tiêu biểu như: chống suy nhược, chống oxy | hỏa, điều hòa miễn dịch, kháng viêm, chống stress… Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu tác dụng của sâm Việt Nam trên mô hình gây hen dị ứng bằng ovalbumin (OVA) thông qua khảo sát định lượng nồng độ interleukin-5 (IL-5) và interleukin-13 (IL-13) trong huyết tương chuột nhắt trắng. Chuột nhắt trắng được gây mẫn cảm bằng cách tiêm phúc mạc OVA (0.2 mg/kg). vào ngày 0 và ngày 14, sau đó được nhắc lại bằng cách thở với khí dung OVA 0,5% từ ngày 20 đến ngày 22. Nồng độ II.5 và IL-13 trong huyết tương được định lượng bằng bộ kit ELISA. Kết quả cho thấy nồng độ IL-5 và IL-13 trong huyết trình chuột bị gây hen bằng OVA giảm (40,6%/IL-5 và 29,9%/IL-13), đạt ý nghĩa thông kể so với lô chứng sinh lý. Việc cho uống bột chiết sâm Việt Nam liều 200 mg/kg (từ ngày 5 đến ngày 22) cũng như sử dụng thuốc đối chiếu terbutalin tiên – 4. (liều 0,3 mg/kg – từ ngày 20 đến ngày 22, trước khi thở OVA 30 phút) làm hồi phục sự thay đổi nồng độ IL-5 và IL-13 và , trị sinh lý bình thường.
Đặt vấn đề
Hen suyễn hay hen phế quản là một bệnh lý viêm mạn tính đường hô hấp phổ biến trên thế giới và Việt Nam. Bệnh gây ảnh hưởng không nhỏ tới sức khỏe và hoạt động hàng ngày của bệnh nhân, bên cạnh đó nếu không được điều trị | kịp thời có thể gây nhiều biến chứng nguy hiểm như tràn dịch màng phổi, bị thiếu oxy gây tím tái, mất ý thức, không cấp cứu kịp thời có thể dẫn tới tử vong.
Đã có nhiều nghiên cứu về tác dụng kháng dị ứng [2] và chống hen suyễn của nhân sâm (Panax ginseng CA Meyer) và hoạt chất ginsenosid Rb1 [3, 4]. Sâm Việt Nam (Sâm Ngọc Linh, Panax vietnamensis Ha et Grushv.) là một loại dược liệu quý đã được đưa vào danh sách các dược liệu trọng điểm và sản phẩm quốc gia, với các tác dụng tiêu biểu như: chống suy nhược, chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch, kháng viêm, chống stress,…[5, 6]. Các hoạt chất thuộc nhóm ocotillol saponin và các chất chuyển hóa có hoạt tính kháng viêm ex vivo điển hình [7].
Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh bột chiết cồn Sâm Việt Nam trồng liều 100 – 200 mg/kg trọng lượng chuột có tác dụng chống hen qua việc điều hòa nồng độ cytokin IL-4 và kháng thể IgE trong huyết tương chuột bị gây mẫn cảm bằng ovalbumin [8]. Kế thừa kết quả nghiên cứu về tác dụng của sâm Việt Nam theo hướng hỗ trợ điều trị hen suyễn, mục tiêu của đề tài:
“Nghiên cứu tác dụng của bột chiết Sâm Việt Nam trên môi hình gây hen dị ứng bằng ovalbumin (OVA) thông qua khảo sát định lượng nồng độ Interleukin-5 và Interleukin-13 trong huyết tương chuột nhắt trắng”
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu
Thân rễ và rễ củ sâm Việt Nam trồng 6 năm tuổi thu hái tại trại Dược liệu Trà Linh tỉnh Quảng Nam. Dùng phương pháp chiết ngấm kiệt với cồn 45%, cô thu hồi dung môi sau đó đồng | khô ở nhiệt độ -50° C dưới áp suất giảm thu được bột chiết sâm Việt Nam (hiệu suất 54,32 %).
Hàm lượng các saponin chính (majonosid-R2 và các ginsenosid) trong bột chiết Sâm được xác định bằng HPLC [6]. Liều bột chiết Sâm được chọn dựa theo liều có tác dụng trong các nghiên cứu trước đây [8].
Động vật thử nghiệm
Chuột nhắt trắng đực (chủng Swiss albino trọng lượng trung bình 25 g+2 g) được cung cấp bởi Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang Chuột được nuôi trong điều kiện ổn định về chế độ chiếu sáng (12 giờ sáng/tôi), dinh dưỡng và được để ổn định 1 tuần trước thực nghiệm. Thể tích tiêm phúc mạc ovalbumin, tiêm dưới da terbutalin hay cho uống mẫu thử là 10 ml/kg trọng lượng chuột.
Thuốc thử nghiệm
Ovalbumin (Nacalai, Japan) và nhôm hydroxid (Merck, Đức). Terbutalin (thuốc đôi chiếu) và các bộ kit định lượng IL-5, IL-13 được mua từ Sigma-Aldrich Co., Mỹ.
Mô hình gây hen thực nghiệm ovalbumin
Dựa theo nghiên cứu của Jeon và cs. [9], Lim và cs. [3] và kế thừa kết quả đã công bố trước [8] Mô hình được tóm tắt như sau:
- Chuột nhắt trăng được gây mẫn cảm bằng cách tiêm phúc mạc OVA (0,2 mg/kg, pha với nhôm hydroxid trong đêm phosphat 0,2 M) vào ngày 0 và ngày 14, sau đó được nhắc lại bằng cách thở với khí dung OVA 0,5% 30 phút/ngày từ ngày 20 đến ngày 22.
- Bột chiết sâm Việt Nam được cho chuột uống ở liều 200 mg/kg vào ngày thứ 5 đến ngày 22 sau liều OVA gây mẫn cảm ban đầu.
- Thuốc đối chiếu terbutalin được tiêm dưới da (liều 0,3 mg/kg) từ ngày 20 đến ngày 22, trước khi thở OVA 30 phút.
- Hai giờ sau lần thở OVA cuối, tiến hành lấy máu tĩnh mạch đuôi chuột để định lượng IL-5 và IL13 trong huyết tương chuột bằng kỹ thuật ELISA.
Định lượng nồng độ cytokin IL-5 hay IL13 trong huyết tương chuột bằng phương pháp ELISA
Thực hiện theo hướng dẫn của bộ kit, tóm tắt như sau:
- Hút các nồng độ IL-5 (hay IL-13) chuẩn và mẫu đo vào các giếng, protein mục tiêu (IL-5 hay IL-13) của mẫu được phát hiện và gắn cố định với kháng thể trong giếng.
- Sau quá trình rửa các protein không được gắn, liên hợp horseradish peroxidase (HRP)-streptavidin được thêm vào các giếng.
- Rửa giếng, sau đó thêm chất nền tạo màu 3,3”,5,5”- tetramethylbenzidin (TMB) vào giếng làm xuất hiện màu xanh với cường độ màu tỷ lệ thuận với lượng IL-5 (hay IL-13) của mẫu định lượng.
- Thêm dung dịch ngừng phản ứng (Stop solution) làm thay đổi màu dung dịch từ màu xanh sang màu vàng và cường độ của màu được đo ở bước sóng 450 nm.
Dựng đường chuẩn độ hấp thu quang học với các nồng độ IL-5 là 0; 0,82; 2,05; 5,12; 12,8; 32; 80; 200 pg/ml (Bảng 1), thu được phương trình tuyến tính y= 0,0024x + 0,0859 với R2 = 0,9993, từ đó suy ra nồng độ IL-5 trong mẫu cần đo.
Dựng đường chuẩn độ hấp thu quang học với các nồng độ IL-13 là 0; 8,23, 24,69; 74,07; 222,2; 666,7; 2000 pg/ml (Bảng 1), thu được phương trình tuyến tính y = 0,0018x + 0,011 với Ro = 0,9998, từ đó suy ra nồng độ IL-13 trong mẫu cần đo.
Đánh giá kết quả
Các số liệu được biểu thị bằng trị số trung bình: M+ SEM (Standard error of the mean – sai số chuẩn của giá trị trung bình) và xử lý thống kê dựa vào phép kiểm One-Way ANOVA và t-test hay Student-Newman-Keuls test (phần mềm SigmaStat – 3.5).
Kết quả thử nghiệm đạt ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% khi p < 0,05 so với lô chứng tương ứng.
Kết quả
Kết quả Hình 1 cho thấy
- Lô chứng bệnh lý được gây hen bằng OVA và uống nước cất trong 22 ngày có nồng độ IL-5 trong huyết tương giảm (40,6%), đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý.
- Lô chuột gây hen bằng OVA và cho uống bột chiết sâm Việt Nam liều 200 mg/kg có nồng độ IL-5 trong huyết tương tăng đạt ý nghĩa thống kê (p <0,05) so với lô chứng bệnh lý và đưa về giá trị tương đương với lô chứng sinh lý.
Nồng độ IL-5 trong huyết tương của lô chuột gây hen bằng OVA và được điều trị bằng terbutalin liều tiêm 0,3 mg/kg tăng đạt ý nghĩa thống kê (p <0,05) so với lô chứng bệnh lý. Không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê giữa giá trị IL-5 của lô uống bột chiết sâm Việt Nam và lộ tiêm terbutalin.
Kết quả Hình 2 cho thấy
- Lô chứng bệnh lý được gây hen bằng OVA và được uống nước cất trong 22 ngày có nồng độ IL-13 trong huyết tương giảm (29,9%), đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý.
- Lô chuột gây hen bằng OVA và được sử dụng bột chiết sâm Việt Nam liều uống 200 mg/kg có nồng độ IL-13 trong huyết tương tăng đạt ý nghĩa thông kể so với lô chứng bệnh lý tương ứng và đưa về giá trị tương đương với lô chứng sinh lý.
Nồng độ IL13 trong huyết tương ở lô chuột gây hen bằng OVA và được điều trị bằng terbutalin liều tiêm 0,3 mg/kg tăng đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý tương ứng và đưa về giá trị bình thường so với lô chứng sinh lý. Không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê giữa giá trị IL13 của lô uống bột chiết sâm Việt Nam và lô tiêm terbutalin.
Bàn luận
Ở người, IL-5 đặc thù cho sự hoạt động của bạch cầu ưa acid và bạch cầu ưa kiềm, đây là hai loại tế bào tham gia chủ yếu trong phản ứng viêm dị ứng. Vì bạch cầu ưa acid chiếm ưu thế trong phản ứng dị ứng, cùng với tính đặc hiệu của IL-5 với loại bạch cầu này đã khiến cho IL-5 trở thành mục tiêu trong điều trị hen phế quản.
IL-5 gây hoạt tính ưa acid và sự thâm nhiễm bạch cầu ưa acid gây viêm phế quản, là đáp ứng quan trọng trong hen suyễn dị ứng [10]. Bệnh nhân hen suyễn được điều trị bằng anti-IL-5 (mepolizumab) có sự giảm bạch cầu ưa acid ở niêm mạc phế quản [11].
IL-13 biệt hóa tế bào tiết nhầy, tăng đáp ứng co thắt khí quản, chuyển đổi kháng thể IgM thành IgE, thúc đẩy sự di cư của bạch cầu ưa acid vào phổi, kích thích tế bào biểu mô phế quản giải phóng eotaxin gây sự quá mẫn của phế quản (airway hyperresponsiveness, AHR. Các nghiên cứu sử dụng liệu pháp kháng thể đơn dòng IL-13 cũng cho thấy tầm quan trọng và hiệu quả trong việc làm giảm các triệu chứng hen suyễn [12, 13].
OVA gây ra hiện tượng dung nạp, đây là hiện tượng không đáp ứng với kháng nguyên khi tiếp xúc với lympho bào của kháng nguyên đó. Yếu tố trên có thể tác động khác nhau lên hệ miễn dịch mà tế bào Tho (naive T cells) được biết là có | khả năng sản xuất cytokin hạn chế (chủ yếu sản sinh ra IL-2) trong khi tế bào T nhớ (memory T cells) có khả năng sản sinh ở mức cao và nhiều loại cytokin khác nhau.
Sự thay đổi sự cân bằng Th1 và Th2 cũng ảnh hưởng đến nồng độ cytokin. Ở cơ thể bình thường, sự cân bằng này được bảo tồn nhờ sự ức chế qua lại giữa hai loại Th1,Th2. Tế bào Th1 tiết IFN-Y ức chế quá trình đáp ứng miễn dịch của tế bào Th2, ngược lại tế bào Th2 tiết IL-4 ức chế quá trình đáp ứng miễn dịch của tế bào Th1. Và chính những biến đổi của Th2 hay Thọ đã làm ảnh hưởng đến quá trình này, có thể Th2 đã bị bất hoạt, thay đổi chức năng, không sản xuất IL-4 nữa, như vậy hoạt động của tế bào Th1 sẽ mạnh hơn, đồng nghĩa với việc cơ thể sẽ chọn con đường đáp ứng miễn dịch theo tế bào Th1 được đặc trưng bởi hoạt động thực bào chí không phải là con đường của tế bào Th2 được đặc trưng qua việc tiết các cytokin [14]. Chính vì lý do đó mà sản phẩm của tế bào Th2 là các cytokin IL-5, IL-13 giảm ở các lô chứng bệnh lý.
Kết quả đề tài tương đồng với các nghiên cứu trước là làm phục hồi về giá trị sinh lý sự thay đổi của các interleukin. Bột chiết sâm Việt Nam có tác dụng phục hồi nồng độ IL-4 và IgE trong huyết tương chuột bị gây hen về giá trị sinh lý bình thường [8]. Sâm Việt Nam được biết chứa nhiều saponin như các ginsenosid có trong Nhân sâm (ginsenosid Rb1, Rd, Re, Rg1,…), đặc biệt là majonosid R2 với hàm lượng cao. Ginsenosid Rb1 được chứng minh là có tác dụng chống hen suyễn thông qua việc giảm sự sản xuất bạch cầu ưa acid, điều hòa cytokin Th1/Th2 [4]. Hoạt chất chính majonosid R2 và vina-ginsenosid R2 được chứng minh ex vivo ức chế biểu hiện cytokin gây viêm [7].
Kết luận
Bột chiết cồn từ sâm Việt Nam trồng liều uống 200 mg/kg có tác dụng điều hòa nồng độ cytokin IL-5 và IL-13 về giá trị sinh lý trong thực nghiệm gây hen dị ứng bằng ovalbumin.
