Khảo sát hoạt tính sinh học cây Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum Thunb. Makino)

Tống Tiểu Hoa, Vũ Thị Bạch Phượng, Dương Công Kiên, Quách Ngô Diễm Phương

Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ, 1(6), tr 49-57

Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum Thunb. Makino) là thảo dược được dân gian sử dụng nhiều trong việc chữa trị các bệnh như đái tháo đường, lipid máu cao, hỗ trợ điều trị tim mạch, ung thư [1]…Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá một số hoạt tính sinh học của cây Giảo cổ lam như khả năng kháng oxy hóa, kháng khuẩn, ức chế enzyme α-glucosidase và enzyme lipase. Qua đó đã chứng minh được tiềm năng có thể làm nguồn dược liệu có giá trị của cao chiết ethanol cây Giảo cổ lam trong việc điều trị một số bệnh phổ biến hiện nay.

---

MỞ ĐẦU

Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum Thunb. Makino) là cây thuốc dân gian của Trung Quốc và Nhật Bản, thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae), là loài dây leo lâu năm, lá kép gồm 5 lá chét mọc xen kẽ. Cây được tìm thấy nhiều ở Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc; ở Việt Nam, cây được tìm thấy ở Lào Cai (Sapa), Hà Giang, Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh (Móng Cái), Hoà Bình, Thừa Thiên – Huế, Kontum, Gia Lai [2].

Hình ảnh cây Giảo cổ lam

Từ xưa, Giảo cổ lam được sử dụng để bồi bổ sức khoẻ, chống lão hóa, trị đái tháo đường [3], và còn có tên là cây cỏ thần kỳ hoặc nhân sâm cho người nghèo vì thành phần có hoạt tính chủ yếu trong cây là các saponin triterpen gọi là gypenoside. Các hoạt tính sinh học chủ yếu của Giảo cổ lam được chứng minh trên thế giới bao gồm kháng oxy hóa, kháng khuẩn, giảm lượng đường huyết, giảm huyết khối, giảm mỡ máu, chống béo phì, kháng ung thư, chống tăng huyết áp, cải thiện hệ miễn dịch, duy trì sức khoẻ tim mạch [3]…

Thành phần hóa học chủ yếu của Giảo cổ lam được công bố ngoài gypenoside còn có các hợp chất tự nhiên như flavonoid, steroid, polysaccharide, phenol,…. Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam chưa có công bố về đánh giá hoạt tính sinh học phổ biến của loài cây này cũng như hoạt tính của cao chiết ethanol so với cao nước.

Vì thế nghiên cứu này được thực hiện nhằm:

==> Đánh giá các hoạt tính sinh học nổi bật của cây Giảo cổ lam như hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa, ức chế enzyme α-glucosidase, lipase đối với các cây được trồng tại Việt Nam nhằm chứng minh giá trị dược liệu của loài cây thuốc dân gian này.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

• Cây Giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum thu hái từ Đà Lạt, Lâm Đồng.
• Các chủng vi khuẩn Các chủng vi khuẩn gây bệnh như Streptococcussp., Salmonella typhi, Acetobacteriumsp., Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli

Các chủng vi sinh vật được cung cấp bởi Phòng Thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.

Điều chế cao chiết

Điều chế cao nước: Cao chiết nước được thực hiện theo phương pháp sắc thuốc truyền thống.

Phơi khô, xay nhỏ toàn bộ cây, cân đúng 250 g bột cây, bổ sung 500 mL nước, gia nhiệt ở 40 º C trong 4 giờ, khuấy đều, lọc lấy phần nước, lặp lại nhiều lần, sau đó phần dịch nước được đông khô chân không thu được cao nước.

Điều chế cao ethanol: Phương pháp điều chế cao được thực hiện theo kỹ thuật chiết ngâm dầm (maceration) [4].

• Toàn cây Giảo cổ lam ngoài tự nhiên đượcrửa sạch bằng nước, phơi khô đến khối lượng không đổi, rồi xay nhuyễn thành bột khô.
• Ngâm bột cây trong ethanol tuyệt đối.
• Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày.
• Sau đó, dung dịch được chiết lọc qua giấy lọc, thu dịch lọc.
• Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình bột mẫu và tiếp tục quá trình chiết thêm vài lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu.
• Phần dịch lọc được cô quay chân không đuổi dung môi ở 40º C để có được cao chiết.

Định tính một số nhóm chức có trong cao chiết:

Cao chiết nước và ethanol của Giảo cổ lam bằng các phản ứng định tính hóa học đặc trưng [4]. Mẫu thử nghiệm được pha trong ethanol tuyệt đối hoặc nước cất (tuỳ loại cao) với nồng độ 1 mg/mL.

• Định tính phenol bằng FeCl3
• Định tính tanin
• Định tính alkaloid
• Định tính flavonoid
• Tác dụng với dung dịch 1 % NaOH/ethanol
• Tác dụng với dung dịch 1 % AlCl3/ethanol
• Phản ứng Cyanidin của Wilstatter
• Định tính terpenoid- steroid Phản ứng Rosenheim để phát hiện steroid – triterpenoid
• Phản ứng Salkowski để phát hiện steroid
• Định tính saponin
• Định tính glycosid

Hoạt tính kháng khuẩn:

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết đã điều chế từ hai dung môi nước và ethanol bằng phương pháp đo đường kính vòng vô khuẩn [5]:

• Nuôi cấy dịch huyền phù vi khuẩn thử nghiệm trong môi trường Luria – Bertani (LB) lỏng lắc ở 37 ºC
• Điều chỉnh dịch huyền phù vi khuẩn đạt độ đục chuẩn BaSO4 0,5 McFarland (OD 625 nm)
• Trải 100μL dịch khuẩn đã chuẩn độ đục lên đĩa petri chứa môi trường thạch LB, tiến hành đục lỗ thạch với đường kính 7 mm; nạp 50 μL cao chiết hòa tan trong DMSO 100 % vào lỗ thạch (nồng độ 10 mg/mL)
• Ủ trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng, sau đó đo đường kính vòng kháng khuẩn, chứng âm DMSO 100 %.

Hoạt tính kháng khuẩn của hợp chất càng mạnh, đường kính vòng kháng khuẩn xung quanh lỗ thạch càng lớn. Lặp lại 3 lần cho mỗi nghiệm thức.

Hoạt tính kháng oxy hóa:

Khảo sát khả năng khử của cao chiết ethanol và nước của cây Giảo cổ lam bằng phương pháp thử năng lực khử của Yen và Duh (1993) [6]

• Hút 1 mL dịch chiết chất thử nghiệm; 2,5 mL dung dịch đệm sodium phosphate 0,2 M pH 6,6; 2,5 mL dung dịch potassium ferricyanide 1 %
• Ổn định ở 50 o C trong 20 phút; thêm 2,5 mL trichloroacetic acid 10 %; ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút; thu dịch nổi
• Hút 1 mL dịch nổi qua ống nghiệm khác; thêm 2 mL nước cất và 0,5 mL dung dịch FeCl3 1 %; lắc đều rồi để yên sau 5 phút; đo ở bước sóng 700 nm.

Giá trị hấp thu càng cao thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa càng mạnh. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.

Khảo sát khả năng đánh bắt gốc tự do bằng phương pháp DPPH [7]:

• Hoà tan cao vào dung môi với nồng độ 2–4 mg/mL, sau đó pha loãng với các đồng độ khác nhau.
• Hút 0,3 mL dung dịch cao ở mỗi nồng độ và 1,8 mL ethanol tuyệt đối vào ống nghiệm.
• Thêm 0,3 mL dung dịch DPPH 0,6 mM (hoà tan trong ethanol tuyệt đối), lắc đều, ủ trong tối, sau 30 phút, đo giá trị hấp thu ở bước sóng 517 nm.
• Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.

Khả năng kháng oxy hóa càng cao thì sự hấp thu quang phổ ở bước sóng 517 nm càng thấp và ngược lại.

Phần trăm ức chế được tính theo công thức: I%= (ODđc- ODmẫu)/ODđc*100

Với ODđc, OD mẫu lần lượt là độ hấp thu của đối chứng và mẫu thử nghiệm.

Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase:

Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của cao chiết Giảo cổ lam được xác định theo phương pháp của Kwon, Apostolidis và Shetty (2008) [8].

• Hoà tan cao trong đệm phosphate 0,2 M chứa 5 % DMSO (chứng dương acarbose 2 mg/L), pha loãng cao thành các nồng độ khác nhau.
• Nhập 50 µL mẫu đã pha loãng vào đĩa 96 giếng, bổ sung 40 µL enzyme α-glucosidase 0,2 u/ml, ủ ở nhiệt độ phòng trong 25 phút.
• Thêm 40 µL cơ chất p-NPG 5mM, tiếp tục ủ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút, sau đó, bổ sung 130 µL Na2CO3 để dừng phản ứng.
• Đo độ hấp thu (OD) ở bước sóng 405 nm.
• Lặp lại 3 lần ở mỗi nghiệm thức.

Phần trăm ức chế của cao chiết được tính theo công thức: I%= (ODđc- ODmẫu)/ODđc*100

Với ODđc, ODmẫu lần lượt là độ hấp thu của đối chứng và mẫu thử nghiệm.

Hoạt tính ức chế enzyme lipase [9]:

• Hoà tan cao với nồng độ 8 mg/mL trong đệm phosphate 0,05 M pH 7,2 chứa 0,1 % Tween 80 và 5% DMSO (chứng dương Orlistat 12 mg/mL).
• Pha loãng mẫu ở các nồng độ giảm dần, hút mỗi nồng độ 20 µL cho vào đĩa 96 giếng đã có sẵn 140 µL đệm và 20 µL enzyme lipase 1 mg/mL, ủ ở nhiệt độ phòng trong 60 phút.
• Thêm 20 µL cơ chất pNPB 5 mM, lắc nhẹ, sau 5 phút đo độ hấp thu (OD) với bước sóng 405 nm.
• Mỗi nghiệm thức được thực hiện 3 lần.

Phần trăm ức chế của cao chiết được tính theo công thức: I%= (ODđc- ODmẫu)/ODđc*100

Với ODđc, ODmẫu lần lượt là độ hấp thu của đối chứng và mẫu thử nghiệm.

Phân tích và xử lý số liệu Các phép toán thống kê được thực hiện bằng phần mềm Microsoft Excel 2013 và SPSS 22.0

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Định tính một số nhóm chức có trong cao chiết

Kết quả định tính cho thấy Giảo cổ lam có chứa nhiều nhóm hợp chất như phenol, alkaloid, flavonoid (flavonol, auron, isoflavol, flavanol, chalcone…), terpenoid, steroid, saponin (Bảng 1).

Kết quả cho thấy:

Cao ethanol cây Giảo cổ lam có nhiều hợp chất hơn cao nước, đáng chú ý là các hợp chất flavonoid và saponin, cao ethanol có cả hai loại saponin triterpenoid và steroid trong khi cao nước chỉ chứa saponin steroid. Chính vì có sự hiện diện của nhiều nhóm hợp chất tự nhiên nên cây Giảo cổ lam có nhiều hoạt tính sinh học có giá trị dược liệu.

• Hơn nữa, theo Zhuohong Xie và cs. (2010) khi nghiên cứu thành phần hóa học của 5 loại Giảo cổ lam thương mại cho thấy trong thành phần Giảo cổ lam có chứa flavonoid cụ thể là rutin và quercetin với hàm lượng cao [10].
• Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng chứng minh Giảo cổ lam có nhiều loại saponin khác nhau có cấu trúc và hoạt tính tương tự như saponin của Panax gingseng [11], cùng với kết quả nghiên cứu này có thể thấy, khi dùng Giảo cổ lam hòa tan trong ethanol (ngâm rượu trong dân gian) hiệu quả hơn so với việc sắc thuốc nước.

Hoạt tính kháng khuẩn

Mỗi lỗ thạch chứa 0,5 mg cao chiết với nồng độ 10 mg/mL hoà tan trong DMSO 100% với chứng dương là kanamycine và chứng âm là DMSO 100 %. Kết quả đo đường kính vòng kháng khuẩn được thể hiện trong Bảng 2.

Kết quả cho thấy:

Cao chiết Giảo cổ lam có khả năng ức chế sinh trưởng các chủng vi khuẩn gây bệnh nhưng không mạnh (đường kính vòng kháng khuẩn <10 mm).

Trong đó, cao ethanol có khả năng ức chế sinh trưởng trên tất cả các chủng vi khuẩn dùng trong thử nghiệm và thể hiện mạnh nhất đối với chủng Pseudomonas (đường kính vòng vô khuẩn là 6,67 mm) và yếu nhất đối với chủng Streptococcus (đường kính vòng vô khuẩn 4,33 mm), tuy nhiên cao nước chỉ có khả năng ức chế sinh trưởng hai chủng là Salmonella và Staphylococcus.

• Nhìn chung, khả năng ức chế sinh trưởng của cao chiết ethanol Giảo cổ lam đối với các chủng Gram âm và Gram dương là tương đương nhau.
• Thêm vào đó, theo Danuree và cs. (2011) [12] khi khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết ethanol và nước với các chủng S. typhi, E. coli, S. aureus cho thấy cao chiết ethanol và nước của Giảo cổ lam có thể ức chế sinh trưởng 3 chủng này với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là 15,62 mg/mL.

Hoạt tính kháng oxy hóa

Khảo sát khả năng khử của cao chiết ethanol và nước của cây Giảo cổ lam. Năng lực khử của cao chiết Giảo cổ lam được thể hiện trong Hình 1 và Bảng 3, 4.

Kết quả cho thấy:

Năng lực khử của một chất là khả năng chất đó cho điện tử khi tham gia phản ứng oxy hóa khử, vì thế, năng lực khử cũng thể hiện khả năng kháng oxy hóa của chất đó. Lực khử được xác định dựa trên sự đổi màu của dung dịch cao chiết khi xảy ra phản ứng với FeCl3 tạo phức chất ferric ferrocyanide có màu xanh, hấp thu cực đại ở bước sóng 700 nm.

Kết quả cho thấy, cao ethanol có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh hơn cao nước, năng lực khử cao hơn gấp 2 lần (0,810 so với 0,396) ở nồng độ 4 mg/mL.

Kết quả kháng oxy hóa bằng phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH của cao ethanol và nước cây Giảo cổ lam và IC50 của từng loại cao được thể hiện trong Hình 1.

Cao ethanol có khả năng bắt gốc tự do DPPH cao hơn cao nước rõ rệt, phần trăm ức chế của cao ethanol cao hơn cao nước gấp 4 lần. Hơn nữa, kết quả định tính trong nghiên cứu này cho thấy cao chiết ethanol có chứa thành phần flavonoidmà theo nhưW. Zhaojing (2007) và E. Kelly (2002) đã công bố là có khả
năng kháng oxy hóa tốt [13, 14].

Hoạt tính ức chế α-glucosidase

Enzyme α-glucosidase thủy phân polysaccharide sau khi thủy giải thành các đường đơn, dễ hấp thu hơn, do đó để chữa bệnh đái tháo đường type 2 cần giảm lượng đường hấp thu vào máu bằng cách ức chế enzyme này, kết quả được thể hiện trong Hình 2 và Bảng 4.

Kết quả cho thấy:

• Cao chiết ethanol có hoạt tính ức chế enzyme α- glucosidase cao hơn nhiều so với cao nước.
• Ở nồng độ 4 mg/mL, phần trăm ức chế của cao ethanol và nước lần lượt là 87,435 % và 54,251 %, cao hơn so với phần trăm ức chế cao nhất của chứng dương ở 20 mg/mL (82,231 %).
• Tương tự, nồng độ ức chế 50 % (IC50) của hai cao lần lượt là 0,181mg/mL và 3,672 mg/mL, cao hơn so với acarbose là 0,411 mg/mL. Có thể thấy rằng cao ethanol do có chứa nhiều thành phần các hợp chất tự nhiên có hoạt tính hơn nên có hoạt tính cao hơn, ức chế enzyme α-glucosidase tốt hơn so với cao nước.

Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của nhóm Huyen và cs. (2012) Đại học Dược Hà Nội về khả năng hỗ trợ chữa bệnh đái tháo đường và cải thiện lượng đường huyết của Giảo cổ lam khi thí nghiệm lâm sàng [15, 16].

Hoạt tính ức chế lipase

Lipase là enzyme đường ruột xúc tác thủy phân lipid thành acid béo tự do để cơ thể hấp thu [8], vì thế để chữa bệnh béo phì cần ức chế enzyme này.

Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế enzyme lipase của cao chiết Giảo cổ lam được thể hiện trong Bảng 2 và Hình 4. Kết quả cho thấy cao ethanol có hoạt tính ức chế enzyme lipase cao nhất là 73,876 % cao hơn cao nước có phần trăm ức chế là 70,927 %. IC50 tương ứng của hai cao là 2,968 mg/mL và 4,483 mg/mL.

Kết quả trên cùng với kết quả định tính các thành nhóm chức cho thấy khả năng ức chế enzyme lipase của cao ethanol vượt trội hơn so với cao nước, liên quan đến sự hiện diện các hợp chất có hoạt tính sinh học cao như phenolic, flavonoid, saponin như công bố củaCristian R. (2006) chứng minh các hợp chất trên đều có khả năng ức chế enzyme lipase [17].

KẾT LUẬN

• Cao chiết cây Giảo cổ lam có các hoạt tính sinh học như kháng oxy hóa, kháng khuẩn, ức chế enzyme α-glucosidase, trong đó, cao ethanol có các hoạt tính cao hơn hẳn cao nước ở tất cả các hoạt tính trong nghiên cứu này như kháng oxy hóa, kháng khuẩn, ức chế enzyme α-glucosidase và lipase.
• Các thành phần hóa học được nhận diện trong cao ethanol đã khẳng định thêm về hoạt tính của cao chiết này. So với cao nước, cao ethanol chứa nhiều thành phần flavonoid và saponin hơn, đây cũng chính là những hợp chất có hoạt tính sinh học chính trong cây. Hơn nữa, cao ethanol cũng cho thấy khả năng ức chế enzyme α-glucosidase vượt trội hơn các hoạt tính khác, điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng của Giảo cổ lam đối với lĩnh vực hỗ trợ chữa trị đái tháo đường type 2 là rất lớn.
• Kết quả này góp phần chứng minh giá trị dược liệu của Giảo cổ lam bên cạnh những ứng dụng đã được dân gian sử dụng.

Nguồn: Tống Tiểu Hoa, Vũ Thị Bạch Phượng, Dương Công Kiên, Quách Ngô Diễm Phương (2017), Khảo sát hoạt tính sinh học cây Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum Thunb. Makino), Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ, 1(6), tr 49-57.