Hà Quang Thanh, Nguyễn Thị Thu Hương* Trung tâm Sâm và Dược liệu tp. Hồ Chí Minh – Viện Dược liệu
*Email: huongsam@hotmail.com
Mục lục
Loãng xương là một bệnh liên quan đến sự rối loạn chuyển hóa xương dẫn đến tăng nguy cơ gãy xương, ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống. Nghiên cứu này khảo sát tác dụng của cao chiết cồn từ rau càng cua trên mô hình chuột nhắt trăng bị gây loãng xương thực nghiệm bằng prednison. Kết quả cho thấy việc sử dụng prednison (liều uống 20 mg/kg) trong 8 tuân làm giảm các chỉ tiêu về sinh hóa như trọng lượng xương, trọng lượng tro và hàm lượng calci và phospho của xương, hàm lượng marker sinh hóa liên quan đến sự tạo xương là osteocalcin trong huyết tương. Việc cho uống cao chiết cồn rau càng cua liều 0,85 g/kg trong 4 tuần có tác dụng làm tăng trọng lượng xương, trọng lượng tro, hàm lượng calci và phospho trong xương và tăng hàm lượng osteocalcin trong huyết tương của chuột bị loãng xương. Tác dụng của cao chiết cồn rau càng cua tương tự như thuốc đối chiếu nhóm bisphosphonat là alendronat (5 mg/kg).
Rau càng cua (Peperomia pellucida L. Kunth, Piperaceae)
Đặt vấn đề
Loãng xương là một bệnh đặc trưng bởi sự suy thoái cấu trúc xương dẫn đến xương bị suy yếu và tăng nguy cơ gãy xương. Glucocorticoid là một hormon do tuyến thượng thận tiết vào trong máu, hiện nay đã được tổng hợp (corticoid) và được dùng để điều trị chủ yếu là tác dụng kháng viêm và kháng dị ứng. Suy giảm chất lượng của xương dẫn đến loãng xương là một tác dụng phụ rất phổ biến của các corticoid khi sử dụng dài ngày, đây là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây loãng xương thứ phát [1].
Rau càng cua (Peperomia pellucida L. Kunth) đã được sử dụng để chữa trị các bệnh liên quan đến xương, ở Việt Nam, rau càng cua được dùng để phòng chống còi xương ở trẻ em và loãng xương người lớn. Tại Cameroon, hạt và thân rau càng cua được dùng điều trị trong các trường hợp gãy xương [2]. Trên những nghiên cứu in vitro, Ngueguim và CS. (2012) đã báo cáo tác dụng bảo vệ xương của cao chiết cồn rau càng cua thông qua tác động lên các nguyên bào xương [3]. Tuy nhiên những nghiên cứu về tác dụng dược lý thực nghiệm của rau càng cua vẫn còn rất hạn chế. Vì những lý do trên, đề tài được tiến hành để khảo sát tác dụng của cao chiết cồn 96% của rau càng cua trên mô hình loãng xương gây bởi prednison, được đánh giá qua các chỉ tiêu về trọng lượng xương, trọng lượng tro xương, hàm lượng calci và phospho của xương và hàm lượng osteocalcin trong huyết tương.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu
Rau càng cua (Peperomia pellucida L. Kunth, Piperaceae) được thu hái ở xã Xuân Thới Đông, huyện Hóc Môn, thành phố Hồ Chí Minh.
- Nguyên liệu được bỏ rễ, được rửa sạch, cắt nhỏ và phơi khô, sau đó đem đi xay nhỏ.
- Bột rau càng cua được chiết bằng phương pháp chiết ngay kiệt với cồn 96% theo tỉ lệ 1:18, thu được dịch chiết rau càng cua, sau đó cô quay áp suất để thu hồi dung môi và tiếp theo cô cách thủy để thu được cao chiết rau càng cua.
Động vật nghiên cứu
Chuột nhắt trắng đặc chủng Swiss albino, 1011 tuần tuổi, trọng lượng trung bình 30 + 4 g, được cung cấp bởi Viện Vắc-xin và Sinh phẩm y tế – thành phố Nha Trang. Chuột được nuôi ở nhiệt độ phòng, 12 giờ sáng-tối, nước uống đầy đủ và thức ăn đủ tiêu chuẩn động vật thí nghiệm cũng được cung cấp từ Viện Vắc-xin và Sinh phẩm y tế – thành phố Nha Trang. Chuột được cho ăn, uống bình thường và được để ổn định hai tuần trước khi thử nghiệm. Thể tích cho uống là 10 ml/kg thể trọng chuột.
Thiết kế thí nghiệm
- Chuột được cho uống prednison (viên nén Prednison 5 mg, Công ty cổ phần Dược phẩm Domesco, liều 20 mg/kg) hằng ngày và liên tục trong 8 tuần
- Sau 4 tuần cho uống với prednison, chia thành các lô chuột (n = 10-12) và cho uống cao chiết rau càng cua (liều uống 0,85 g/kg và 1,7 g/kg) và thuốc đối chiếu alendronat (Alendronat sodium,Sigma-Aldrich, liều uống 5 mg/kg) hàng ngày, liên tục trong 4 tuần sau khi đã uống prednison 1 giờ.
- Sau 8 tuần, vào ngày cuối cùng chuột được cho nhịn đói trong 10 giờ sau đó là máu để phân tích osteocalcin.
- Mẫu xương đùi tôi được thu nhận sau khi lấy máu để đánh giá các chỉ tiêu về trọng lượng xương, trọng lượng tro xương hàm lượng calci và hàm lượng phospho [4].
Khảo sát trọng lượng xương và tro xương:
Chuột sau khi bị giết được đặt lên bàn mổ, phần giữa bụng được rạch một đường từ đó kéo dài qua hai bên xuống đùi, dùng kéo tách phần cơ xung qua khớp háng và từ đó xương đùi được lấy ra, lông, da và cơ xung quanh xương đùi được hại bỏ bằng nhíp và kéo nhỏ.
Xương đùi trái được đùng để khảo sát các chỉ tiêu về trọng lượng, tổng khoáng, phospho và calci, xương đùi phải dùng cho khảo sát về mô học. Sau khi được cân trọng lượng tươi, xương đùi trái được tiến hành sấy ở nhiệt độ 105°C đến trọng lượng không đổi, ghi nhận trọng lượng khô. Tiếp theo xương được nung ở nhiệt độ 550°C trong 4 giờ để loại bỏ các chất hữu cơ, cân trọng lượng phần tro xương và đây chính là giá trị tổng khoáng trên xương.
Trọng lượng xương và trọng lượng tro xương được tính theo mg/g thể trọng chuột.
Xác định phospho của xương chuột bằng phương pháp so màu:
Hàm lượng phospho được xác định dựa trên quy trình phân tích chuẩn xác định hàm lượng phosphorus bằng phương pháp quang phổ [5]. Phần tro xương đùi được hòa tan trong 10 ml HCL 1M. Hút 0,01 ml dung dịch tro xương vào ống nghiệm, thêm 1,5 ml nước cất và 2 ml natri molypdat (acid ascorbic thêm vào làm tác nhân khử), lắc đều. Đun cách thủy các ống nghiệm 15 phút sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng, thêm nước cất vừa đủ 10 ml. Cường độ màu của phức màu xanh da trời (MoO4Mod HPO4) được đo bằng máy quang phổ ở bước sóng 823 nm. Sau đó thiết lập đường chuẩn phospho (y = 0,8131 + 0,0074 với R2= 0,9998) để xác định được hàm lượng phospho của xương (được tính theo mg/g thể trọng chuột) dựa trên công thức:
X= (D/N)/1000 x W
- X: hàm lượng phospho trong xương (mg)
- D: nồng độ phospho trong dung dịch đo (mg/l)
- N: % dịch xương trong dung dịch đo (0,2%)
- W: thể tích dịch chiết HCl 1M dùng hòa tan xương (10 ml)
Hàm lượng phospho được tính theo mg/g thể trọng chuột.
Xác định calci của xương chuột:
Hàm lượng calci trong xương được xác định bằng phương pháp phổ hấp thu nguyên tử (Atomic absorption spectrometer), đây là phương pháp phân tích phổ để định lượng các nguyên tố hóa học dựa vào sự hấp thụ bức xạ quang học bởi các nguyên tử tự do ở trạng thái khí. Mẫu được vô cơ hóa và hòa tan trong dung dịch HCl trước | đó được sử dụng để chạy máy. Điều kiện chạy máy: Bước sóng đo là 422,5 nm; khe đo là 0,5 | nm; cường độ dòng đèn là 10 nm; chế độ đo được hiệu chỉnh nền bằng đèn D2 và sử dụng dòng khí hỗn hợp là không khí/CHA-2,2 L/phút. Hàm lượng calci được suy ra từ phương trình đường chuẩn xây dựng với nồng độ từ 0,25 đến 2,5 mg/1. |
Từ đó tính được nồng độ calci trong dung dịch và suy ra hàm lược calci (được tính theo mg/g thể trọng chuột) dựa trên công thức:
Y=(C/1000) x W
- Y: hàm lượng calci trong xương (mg)
- C: nồng độ calci trong dung dịch xương (mg/l)
- W: thể tích dịch chiết HCl 1M dùng hòa tan xương (10 ml)
Khảo sát hàm lượng osteocalcin trong huyết tương:
Hàm lượng osteocalcin trong huyết tương chuột được xác định bằng phương pháp ELISA theo protocol của bộ kit Mouse Osteocalcin (MyBioSource Co., USA).
Đánh giá kết quả
Các kết quả thu được trong các thử nghiệm được biểu thị bằng số trung bình M + SEM (Standar Error of The Mean: sai số chuẩn của giá trị trung bình) và xử lý kết quả thống kê dựa vào phép kiểm One-way ANOVA và StudentNewman-Keuls test với độ tin cậy 95% (p < 0,05) bằng phần mềm SigmaStat 3.5 (Sigstat Sofware Inc., Germany).
Kết quả và bàn luận
Trọng lượng xương và trọng lượng tro xương
Kết quả Hình 1 và Hình 2 cho thấy trọng lượng xương và tro xương đùi ở nhóm chuột bình thường không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kể so với lô chứng sinh lý. Ở nhóm chuột cho uống prednison, lô chứng bệnh lý sau 8 tuần có sự giảm trọng lượng xương và tro xương đạt ý 1 nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý.
- Lô cho 1 uống prednison và được cho uống cao chiết cồn rau càng cua liều 0,85 g/kg và alendronat sau 4 tuần có sự tăng trọng lượng xương và tro xương đạt ý nghĩa thống kê so với chứng bệnh lý và hồi phục về giá trị bình thường ở cả 2 chỉ tiêu.
- Lô cho uống cao chiết cồn rau càng cua liều 1.7 g/kg có sự tăng trọng lượng xương và tro xương nhưng chưa đạt ý nghĩa thống kê so với chứng bệnh lý.
Hình 1. Ảnh hưởng của cao cồn chiết rau càng cua lên trọng lượng xương của chuột thí nghiệm
Hình 2. Ảnh hưởng của cao cồn chiết rau càng cua lên trọng lượng tro xương của chuột thí nghiệm
Hàm lượng phospho và calci trong xương
Hình 3. Ảnh hưởng của cao cồn chiết rau càng cua lên hàm lượng calci trong xương của chuột
Hình 4. Ảnh hưởng của cao cồn chiết rau càng cua lên hàm lượng phospho trong xương đùi của chuột
Kết quả Hình 3 và Hình 4 cho thấy hàm lượng calci và hàm lượng phospho trong xương ở các lô được cho uống cao chiết cồn rau càng cua và alendronat trong nhóm chuột bình thường không có sự thay đổi đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý.
Lô chứng trong nhóm chuột gây loãng xương bằng prednison (chứng bệnh lý) sau 8 tuần có sự giảm hàm lượng calci và phospho trong xương, đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý.
Lô chuột bị gây loãng xương bằng prednison và được cho uống alendronat hay cao chiết cồn rau càng cua liều 0,85 g/kg có hàm lượng calci và hàm lượng phospho trong xương tăng đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý.
Lô chuột được điều trị bằng cao chiết cồn rau càng cua liều 1,7 g/kg có hàm lượng calci và hàm lượng phospho trong xương tăng so với chứng bệnh lý nhưng chưa đạt ý nghĩa thống kê.
Hàm lượng osteocalcin trong huyết tương
Kết quả ở Hình 5 cho thấy hàm lượng osteocalcin trong huyết tương của lô chứng bệnh lý giảm đạt ý nghĩa thống kê so với chúng sinh lý.
Lô chuột bị gây loãng xương bằng prednison và được cho uống alendronat hay cao chiết cồn rau càng cua liều 0,85 g/kg có sự tăng hàm lượng osteocalcin đạt ý nghĩa thống kê so với chứng bệnh lý và hồi phục về giá trị sinh lý bình thường. Việc điều trị bằng cao chiết cồn rau càng cua liều 1,7 g/kg không mang lại sự khác biệt về thống kê so với chứng bệnh lý.
Hình 5. Ảnh hưởng của cao cồn chiết rau càng cua lên hàm lượng osteocalci trong huyết tương
Bàn luận
Kế thừa từ kết quả của công trình nghiên cứu trước cho thấy qua khảo sát ở các liêu uống prednison 5, 10 và 20 mg/kg sau 4, 6 và 8 tuần trên chuột nhắt trắng chủng Swiss albino, chúng tôi đã ghi nhận sự giảm trọng lượng tro xương, hàm lượng phospho, calci trong xương và các thay đổi về mô học xương thể hiện điển hình ở liều prednison là 20 mg/kg so với các liều 5 và 10 mg/kg [4]. Kết quả nghiên cứu về mô học xương đùi của chuột cho thấy lô chứng bệnh lý cho uống prednison trong 8 tuần có 90% chuột bị loãng xương, có sự phân bố thưa thớt và không đều các tế bào xương trong các khu vực xương đặc và xương xốp và có sự giảm mật độ của mạng lưới các kè xương, chứng tỏ có sự rối loạn trong quá trình tạo xương và tái cấu trúc xương (bone remodeling), có sự tiêu xương diễn ra mà không có sự hình thành bù đắp tương ứng [6]. Việc điều trị bằng alendronat, là một bisphosphonat có tác dụng liên kết với xương để ức chế các tế bào hủy xương (osteoclast), có tác dụng phục hồi các nguyên bào xương, tế bào xương và làm giảm các khuyết hỏng trong cấu trúc mô học xương gây ra bởi prednison [6]. Do đó, liều uống prednison trong 8 tuần đã được lựa chọn để gây mô hình bệnh lý trong nghiên cứu này.
Đề tài chọn cao chiết cồn 96% của rau càng cua dựa trên nghiên cứu của Putri và cs. (2016). [7], nghiên cứu này đã khảo sát tác dụng ngăn ngừa loãng xương của cao chiết cồn 96% của rau càng cua ở liều 50 mg/kg và 100 mg/kg trên mô hình chuột cống trắng bị cắt buồng trứng. Ngoài ra, hợp chất chính trong rau càng cua chủ yếu là các flavonoid aglycon – dễ tan trong dung môi ít. phân cực, nên côn 96% đã được chọn để tiến hành chiết xuất dược liệu.
Trọng lượng xương và tro xương là các chỉ tiêu biểu thị hàm lượng khoáng trong xương, có mối tương quan tỉ lệ thuận với nhau và thường được dùng để đánh giá chất lượng xương. Trọng lượng xương và tro xương ở nhóm bệnh lý giảm đạt ý nghĩa thống kê so với nhóm sinh lý cho thấy prednison, một glucocorticoid tổng hợp, đã ức chế sự tạo xương, làm giảm trọng lượng xương. Glucocorticoid ức chế sự tạo xương bằng cách làm thay đổi hoạt động của các tế bào xương và tế bào tạo xương, tác động tới các hoạt động chuyển hóa trong xương, làm giảm hàm lượng khoáng trong xương, vì vậy trọng lượng tro xương cũng giảm theo [8]. Kết quả đề tài. tương tự với nghiên cứu của Yao và cs. T91. Ngueguim và cs. (2013) đã công bố tác dụng của cao chiết côn rau càng cua trong việc phục hồi vết nứt thông qua các tế bào tạo xương [3]. Do đó cao chiết côn 96% của rau càng cua, tương tự như alendronat, một thuốc điều trị loãng xương nhóm bisphosphonat, có thể cải thiện cấu trúc vị mô của xương, tăng sự tái tạo xương ở chỗ nứt gãy xương gây bởi việc sử dụng dài ngày prednison. Những khảo sát về mô học xương đang được thực hiện để làm rõ giả thuyết này.
Calci và phospho là hai thành phần chính trong xương, vì vậy đánh giá hàm lượng calci và phospho của xương biểu thị sự thay đổi về khoáng chất trong xương, cho cái nhìn chính xác nhất về chất lượng xương. Do hai khoáng chất này tồn tại trong xương chủ yếu dưới dạng hydroxyl calcium phosphat Cas(PO4)3(OH) nên ti lệ của hai chất này có sự tương quan về nông dọ• Ngoài ra, calci và phospho còn liên quan đến các quá trình chuyển hóa trong xương và các qua trình chuyển hóa trong cơ thể. Hàm lượng calo và hàm lượng phospho trong xương của lô chứng bệnh lý uống prednison trong 8 tuần giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô sinh lý cho thấy sự trình tiêu xương xảy ra nhiều hơn so với bình thường. Kết quả tương tự với nghiên . của Beier và cs. [10]. Trong nhóm bệnh lý, điều trị bằng alendronat hay uống cao chiết rau càng cua liều 0,85 g/kg sau 4 tuần có hàm lượng calci và hàm lượng phospho trong xe tăng đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh cho thấy có sự tăng hàm lượng khoáng 9 xương, giúp ngăn ngừa việc mất xương.
Hàm lượng osteocalcin trong huyết tương là một marker của các tế bào tạo xương (osteoblast). Nguyên nhân chính làm giảm khối lượng xương trong loãng xương gây ra bởi glucocorticoid là do giảm số lượng và suy giảm chức năng của các Osteoblast, dẫn đến giảm sự tạo xương. Glucocorticoid ở liều thấp tốt cho sự biệt hóa của các tế bào osteoblast và đảm bảo chức năng bình thường của các tế bào này bằng cách tăng biểu hiện các dấu hiệu xương trưởng thành, như alkalin phosphatase và osteocalcin. Tuy nhiên, glucocorticoid được sử dụng ở liều cao hay sử dụng dài ngày để đạt được sự ức chế miễn dịch lâm sàng, làm giảm đáng kể số lượng và chức năng của osteoblast trưởng thành, thông qua việc làm giảm nồng độ osteocalcin [1]. Hàm lượng Osteocalcin giảm đạt ý nghĩa thống kê ở lô chứng bệnh lý cho thấy prednison sau 8 tuần sử dụng có tác động làm giảm hoạt động của các osteoblast. Kết quả tương tự cũng được ghi nhận trong nghiên cứu của Sobhani và cs. [11]. Việc điều trị bằng alendronat hay cho uống cao chiết cồn rau càng cua liều 0,85 g/kg có tác dụng làm tăng hàm lượng osteocalcin trong huyết tương cho thấy có sự phục hồi số lượng các osteoblast, tương đồng với nghiên cứu của Ngueguim và cs. [3].
Việc điều trị với cao chiết cồn rau càng cua trên các thay đổi về chất lượng xương gây ra bởi prednison chưa thấy có sự phụ thuộc vào liều. Đề tài chưa ghi nhận được sự thay đổi đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng không điều trị về các chỉ tiêu khối lượng xương, tổng lượng khoáng trong xương, hàm lượng phospho-calci trong xương và hàm lượng osteocalcin trong huyết tương ở lô được cho uống cao chiết cồn rau càng cua liều 1,7 g/kg. Điều này cần phải được khảo sát thêm về mô học xương, về dược động học hoặc những tương tác có thể có giữa cao thủ nghiệm với prednison.
Kết luận
Việc điều trị bằng cao chiết cồn 96% từ rau càng cua liều 0,85 g/kg có tác dụng phục hồi sự suy thoái về chất lượng xương gây ra bởi prednison, biểu hiện qua sự tăng khối lượng xương, tổng lượng khoáng trong xương, tăng hàm lượng phospho và calci trong xương.
Bên cạnh đó, cao rau càng cua liều 0,85 g/kg còn tăng sự tạo xương thông qua việc làm tăng marker sinh hóa liên quan đến sự tạo xương là osteocalcin.
[Nguồn Tạp chí Dược Học]
