Nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết tỏi (Allium sativum L.) Đối với E.coli gây bệnh và E.coli kháng ampicillin, kanamycin

Nguyễn Thanh Hải, Bùi Thị Tho (2013)
Tạp chí Khoa học và Phát triển 2013, tập 11, số 6, trang 804-808

Nghiên cứu được tiến hành nhằm kiểm tra khả năng diệt khuẩn của dịch chiết tỏi (Allium sativum L.) trong 7 dung môi khác nhau (nước cất, acid acetic 5%, ethanol 35%, ethanol 70%, methanol 70%, axeton 70%, axetonitrile 70%) đối với vi khuẩn E.coli (1 chủng E.coli O44 phân lập từ phân gia cầm bị bệnh tiêu chảy; chủng E. coli Top 10 đã có plasmid kháng đơn thuốc: E.coli Top 10 pJET 1.2/blunt kháng ampicillin và E. coli Top 10 pPS1 kháng kanamycin). Kết quả cho thấy cả 7 loại dung môi đều có thể thu được dịch chiết tỏi có khả năng tiêu diệt các chủng E.coli trên. Trong đó có 3 dung môi dùng để thu dịch chiết cho kết quả diệt khuẩn đạt độ mẫn cảm cao (đường kính vòng vô khuẩn ≥ 20mm) là: axetonitrile 70%, axit axetic 5%, axeton 70%.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh hiện đang trở thành vấn đề lớn trên toàn thế giới. Vi khuẩn kháng thuốc không chỉ làm giảm thậm chí mất hiệu lực điều trị bệnh của vật nuôi và người, mà còn làm ô nhiễm môi trường sống, ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống cộng đồng.

Các chất có nguồn gốc tự nhiên là một nguồn lợi đáng kể để nghiên cứu và sản xuất thuốc thảo thay thế các chất hóa học tổng hợp (Cos et al., 2006; Solanki, 2010.). Thảo dược đang ngày càng chứng minh vai trò quan trọng của mình trong nền công nghiệp dược phẩm như là một giải pháp an toàn sinh học thay thế cho các thuốc hóa học tổng hợp (Mahesh et al., 2008). Thảo dược được ưa chuộng bởi tính an toàn sinh học, không có hay ít có tác dụng phụ, thậm chí chưa tìm thấy vi khuẩn kháng thuốc (Seyyednejad et al., 2010). Tỏi là một thảo dược quý có chứa kháng sinh thực vật với rất nhiều ưu điểm.

Trong tỏi, ngoài chất allicin – kháng sinh thảo mộc rất mạnh, còn chứa các hợp chất sulphur và polyphenol có nhiều tác dụng sinh học khác (Vũ Xuân Quang, 1993; Nguyễn Thanh Hải, Bùi Thị Tho 805 Bùi Thị Tho và Nguyễn Thị Thanh Hà, 2009; Rahman et al., 2012; Gull et al., 2012 ). Tỏi đã được sử dụng nhiều trong phòng và trị bệnh ở người và vật nuôi, theo cách truyền thống.

Gần đây, không chỉ ở Việt Nam mà nhiều nước trên thế giới đã chiết tách và sử dụng những hoạt chất của tỏi như những dược phấm quý trong y học và thú y (Đỗ Tất Lợi, 1999; Bùi Thị Tho và Nguyễn Thị Thanh Hà, 2009). Mục tiêu của nghiên cứu này là tìm ra các dung môi hữu cơ có khả năng hòa tan tốt phytocid có trong tỏi, ngoài ra còn nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết đối với E coli Top 10 có chứa có plasmid kháng đơn thuốc (ampicillin và kanamycin).

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu nghiên cứu

• Giống tỏi trắng – tỏi ta (Allium. sativum L.) được trồng vào vụ đông tại Kinh Môn – Hải Dương, thu hoạch, phơi khô và bảo quản trong nhà nơi khô thoáng. Dịch chiết của tỏi trong các dung môi khác nhau (nước cất, acid acetic 5%, ethanol 35%, ethanol 70%, methanol 70%, axeton 70%, axetonitrile 70%).
• Vi khuẩn E.coli O44 phân lập từ phân gia cầm bị bệnh tiêu chảy do bộ môn vi sinh vật truyền nhiễm Khoa Thú y Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội cung cấp.

Phương pháp nghiên cứu

Thu dịch chiết tỏi:

• Bóc bỏ vỏ lụa thu ánh tỏi (Bulbus allii), nghiền mịn trong các dung môi hữu cơ theo tỷ lệ 1:1 (1g tỏi: 1ml dung môi)
• Dịch này được bảo quản 2 giờ ở nhiệt độ phòng, lọc qua gạc.
• Dung dịch chiết được siêu âm trong 30 phút ở điều kiện lạnh.
• Tiếp tục li tâm với tốc độ 3500 vòng/phút trong 20 phút. Hút lấy dịch trong, mang đi cô quay hút chân không để loại bỏ hoàn toàn dung môi.
• Dịch chiết đã được loại bỏ dung môi được bảo quản trong tủ mát 40 C.

Nuôi cấy vi khuẩn E.coli trên môi trường rắn và lỏng

• Vi khuẩn E.coli được cấy vạch trong môi trường LB đặc, trên đĩa petri ủ 370 C/24h, để chọn khuẩn lạc đơn điển hình.
• Khuẩn lạc đơn được nuôi cấy trong bình tam giác với môi trường LB lỏng, đặt trong tủ bảo ôn ở 370 C, với tốc độ lắc 200 vòng/phút trong 12 – 14h
• Thu dịch khuẩn (mật độ vi khuẩn phải đạt 108 tế bào/ml là đạt chuẩn).

Xác định mật độ vi khuẩn Mật độ vi khuẩn sau khi nuôi cấy trong môi trường LB lỏng được xác định theo phương pháp đo mật độ quang (OD) ở bước sóng λ= 600nm.

Kiểm tra tác dụng diệt khuẩn của các dịch chiết bằng phương pháp kháng sinh đồ khuyếch tán trên đĩa thạch của Kirby-Bauer.

• Các thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
• Khi mật độ vi khuẩn đạt 108 tế bào/ml, lắc đều bình chứa vi khuẩn, dùng pipet man hút 100µl canh khuẩn nhỏ vào giữa đĩa thạch, dùng que thủy tinh tráng đều cho đến khi mặt thạch khô.
• Sau 15 phút đục lỗ trên mặt thạch với đường kính 6mm/lỗ đục cách nhau khoảng 20mm.
• Mỗi lỗ thạch, nhỏ 100µl dịch chiết, đặt đĩa vào tủ ấm ở 370 C/24h đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn, rồi tính số bình quân.

Phương pháp xử lý số liệu

Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên và được lặp lại 3 lần. Số liệu thu được xử lý thống kê sinh học bằng phần mềm Excel 2007. Nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết tỏi (Allium sativum L.) đối với E.coli gây bệnh và E.coli kháng ampicillin, kanamycin 806

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Thu dịch chiết tỏi trên các loại dung môi khác nhau

Kết quả thu dịch chiết tỏi trong 7 loại dung môi cho thấy, cùng một tỷ lệ pha loãng nhưng dịch chiết thu được từ các dung môi lại có các mầu sắc và mùi vị khác nhau. Các dịch chiết tỏi thu được có mầu sắc biến đổi từ vàng nhạt đến vàng đậm (Hình 1).

Trong các loại dung môi đã sử dụng thì ethanol cho màu sắc đậm hơn các dung môi khác (nồng độ ethanol càng cao mầu sắc càng đậm).

Kiểm tra tác dụng tiêu diệt vi khuẩn E.coli của các dịch chiết tỏi

Tác dụng tiêu diệt vi khuẩn của dịch chiết tỏi trên E.coli O44 gây bệnh

Mẫu dịch chiết tỏi thu được từ thí nghiệm 1, được sử dụng để đánh giá khả năng diệt khuẩn E.coli O44 gây bệnh, bằng phương pháp khuyếch tán trên thạch. Kết quả được thể hiện trên hình 2 và bảng 1.

Kết quả cho thấy tất cả 7 loại dịch chiết của tỏi trong các dung môi khác nhau đều có khả năng tiêu diệt E.coli O44 gây bệnh.

Theo nghiên cứu của tác giả Srinivasan et al. (2009), thì dịch chiết tỏi trong nước ở các pH khác nhau (5,8 – 9) có tác dụng tiêu diệt vi khuẩn E.coli có độ dao động lớn (đường kính vòng vô khuẩn giao động từ 12 – 33,0mm); còn tác giả Sana Mukhtar et al. (2012) khi nghiên cứu trên chủng E.coli (ATCC 25922) với dung môi là ethanol ở các nồng độ khác nhau cho đường kính vòng vô khuẩn từ 18,0 – 22,0mm.

ới 3 dung môi phổ thông (nước, ethanol 35% và acid acetic) thì dịch chiết của tỏi trong acid acetic 5% cho vòng vô khuẩn trung bình lớn nhất, đạt độ mẫn cảm cao. Dựa trên phân loại về độ mẫn cảm của vi khuẩn, còn có 2 loại dịch chiết tỏi khác cũng đạt độ mẫm cảm cao (đường kính vòng vô khuẩn ≥ 20mm) theo thứ tự lần lượt là axetonitrile 70%, axeton 70%.

Dịch chiết của tỏi có tác dụng tiêu diệt vi khuẩn tốt hơn kanamycin. Với kanamycin, đường kính vòng vô khuẩn chỉ đạt 15,0mm trong khi đó đường kính vòng vô khuẩn của dịch chiết tỏi thấp nhất cũng là 18,8 mm. Sự chênh lệch này có ý nghĩa thống kê sinh học. Trong thí nghiệm, vi khuẩn E.coli O44 gây bệnh đã kháng lại ampicillin (không có vòng vô khuẩn xem ảnh B, Hình 2).

Tác dụng tiêu diệt vi khuẩn của các loại dịch chiết tỏi trên E.coli chứa plasmid có gen kháng kháng sinh

Kết qủa kiểm tra tác dụng của 7 loại dịch chiết tỏi trên E. coli chứa plasmid có gen kháng thuốc có chứa gen kháng thuốc (E.coli Top 10 pJET 1.2/blunt kháng ampicillin và E. coli Top 10 pPS1 kháng kanamycin) được thể hiện ở hình 3 và bảng 2.

Với vi khuẩn chứa gen kháng thuốc, kết quả cho thấy đường kính vòng vô khuẩn bình quân đều lớn hơn so với chủng E.coli O44 gây bệnh ở cả 7 loại dịch chiết của tỏi. Đường kính vòng vô khuẩn bình quân của chủng E.coli có chứa 2 loại plasmid khác nhau.

Nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết tỏi (Allium sativum L.) đối với E.coli gây bệnh và E.coli kháng ampicillin, kanamycin 808 Bảng 2.

(pJET 1.2/blunt, pPS1) đều không có sự sai khác mang ý nghĩa về mặt thống kê sinh học khi sử dụng cùng một loại dịch chiết tỏi.

Kết quả đã khẳng định dịch chiết tỏi có tác dụng tiêu diệt vi khuẩn rất tốt không chỉ trên E.coli O44 gây bệnh mà còn có tác dụng trên E. coli chứa plasmid có gen kháng kháng sinh (ampicillin và kanamycin). Theo kết quả nghiên cứu của Palaksha et al. (2010) còn cho biết dịch chiết tỏi có tác dụng với E.coli kháng streptomycin.

KẾT LUẬN

• Sử dụng cả 7 loại dung môi để chiết tỏi đều cho kết quả diệt vi khuẩn E. coli O44 gây bệnh.
• Trong đó 3 dung môi dùng để thu dịch chiết cho kết quả tiêu diệt vi khuẩn đạt độ mẫn cảm cao (đường kính vòng vô khuẩn ≥ 20mm) là: axetonitrile 70%, axit axetic 5%, axeton 70%.
• Dịch chiết tỏi thu được còn có tác dụng diệt khuẩn cả đối với chủng E.coli kháng kháng sinh (E.coli Top 10 pJET 1.2/blunt kháng ampicillin, E.coli Top 10 pPS1 kháng kanamycin).

Nguồn: Nguyễn Thanh Hải, Bùi Thị Tho (2013), Nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết tỏi (Allium sativum L.) Đối với E.coli gây bệnh và E.coli kháng ampicillin, kanamycin, Tạp chí Khoa học và Phát triển 2013, 11(6), tr. 804-808.